CAPP-Seq:ctDNA检测利器

CAPP-Seq:ctDNA检测利器 循环肿瘤DNA(ctDNA)对于评估癌症符合来说是一个很有前景的非侵入性方法,但是目前检测ctDNA的方法存在敏感性受限或病人覆盖率的不足,作者通过深度测序癌症个性化图谱cancerpersonalized profiling by deep sequencing (CAPP-Seq),量化ctDNA,对非小细胞肺癌(NSCLC)进行CAPP-Seq,设计的突变点覆盖超过了95%的NSCLC。 为了设计这个NSCLC“筛选器”,作者从COSMIC和其他数据库中挑选了潜在驱动基因的覆盖复发突变的外显子,在TCGA中407个NSCLC行全外显子测序,并运用迭代算法,以选择最少的位点涵盖最多的错义突变病人数。

Fig1 CAPP-Seq设计方案:

六步设计了这个NSCLC筛选器:1.检测非小细胞肺癌中捕获的已知和可疑的驱动突变,2-4.增加了含有复发性单核苷酸变异SNVs的外显子,5-6.增加了内含子和在基因重排断裂位点外显子(ALK、ROS1、RET),最后检测的长度达到125kb,靶向设计了521外显子,13个内含子,中位检测SNVs是4个,覆盖96%的NSCLC。在训练集及验证集中达到高度一致性。

Fig2概括了CAPP-Seq的数据特征:

血浆中循环DNA片段的长度分布,大部分落在170bp(fig2a),所有基因组(b)及4个病人(c)血浆DNA测序深度的范围,可见大多在10000×,有很好一致性。

CAPP中非参等位基因分布,发现本底中位值和均值分别是0.0003%、0.006%,这远远低于ctDNA比例,说明并不会影响ctDNA检出(fig2d)。多种非肿瘤组织(如一些癌前细胞)可以释放出非生殖系ctDNA,这样的生物学本底(或背景)同样影响CAPP-Seq的敏感性,因此分析40份血浆中(35份NSCLC,5份正常)107个癌症相关SNVs,发现大部分都在底下,<0.01%(其实还有相当一部分是在这个值以上的)(e),并检测了一些热点突变发现TP53 R175H频率特别高 ~0.18%,其他的都在0.01%以下,故需要排除TP53 R175H,以免影响真实的生物学克隆异质性(f)。

下一步作者就是开始以经验为基准的检测了CAPP-Seq的检测极限和检测结果的线性相关,说明在不同稀释程度下实际检测和理论检测有较高的一致性。 虽然本底较低,但CAPP-Seq要基于充足的血量,对于获取有限血量的标本来说(如贫血、并发症、身体机能差等)这样的本底还是大大限制了ctDNA的检出率,而影响ctDNA量主要是1、文库中cfDNA重新获取的量,2、肿瘤特异性ctDNA量。

左图可见ctDNA等位基因频率在0.2%本底误差开始逐渐明显,而达到CAPP-Seq检测极限0.02%时人工误差达到50%,因此降低误差是尤为重要。故作者今年对CAPP-seq进行了优化,引进了集成数字误差抑制(integrated digital error suppression,iDES),结合肿瘤中消除原本较高的本底噪音和分子条码技术策略,从而获得有效的cfDNA,大大降低了本底噪音。这两种方案能分别使CAPP-seq敏感性提升3倍,而结合后提升15倍,右图所见。

iDES设计

利用两个插入条码、两个索引条码及适配器组装双链DNA,分别扩增,最后得到相对较纯反义链,再重新组装成-无PCR扩增产生的随机突变-无探针富集时由氧化导致的单链突变-拥有真实突变的双链DNA(a),结合条码技术及背景抛光协同使无错误位点从90%升至98%,全误差率低至0.0015%(b),b中还可见G>T的颠换发生错误最大。

17个患者基本信息及治疗前CAPP-Seq检测的结果

可见有两例I期患者(p12、p17)没有检测出ctDNA,而其余II~IV期都有检测出,且IV期的看似ctDNA量要多点,但是也有例外如p4患者,虽然是IV期,但是ctDNA量反而没III期的多,是否其肿瘤活性较低引起有待思考,有融合基因的几乎都是没有抽烟及抽烟较轻的患者,这些患者SNVs也较少。

对Table1中13个NSCLC患者和5个健康人进行CAPP-Seq后分析其敏感性及特异性发现II~IV期患者敏感性和特异性达到了100%和96%(fig3a),且肿瘤大小与ctDNA量成正相关(c)。

iDES-enhancedCAPP-Seq特征

采用iDES可使假阳性基本消失,敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值都达到最大,并且与ddPCR对比,等位基因频率有较高的一致性。

检测肿瘤热点突变中iDES能使阳性预测值PPV提升至70%,并且能使肿瘤配对样本中没有检测的cfDNA达到最低(d)。在检测EGFR突变中发现敏感性和特异性同时达到100%,而针对不同突变L858R、Exon 19 del、T790M时特异性和PPV达到100%,敏感性也有91%~96%(e、f)。

CAPP-Seq临床应用

(fig4)基于CAPP-seq检测NSCLC患者ctDNA监测肿瘤负荷,可见ctDNA不仅能很好的反应肿瘤大小,还能反应出肿瘤的活性(e),且比影像学更加灵敏。也有例外如(f)治疗后肿瘤体积缩小了,但ctDNA反而上升了,这里不好解释了。

iDES-enhanced CAPP-Seq临床应用

iDES的检测极限达到0.0025%,这里的c只有用iDES在肺癌治疗1个月肿瘤负荷相对较低的时候才能检测出,而其他方法都检测不出。真因为iDES检测的阳性预测值更高了,这也可以解释上图中f,可能是由于假阳性的结果。 总结 用CAPP-seq可检测100%的II~IV期NSCLC,I期检测是50%。该方法特异性高达96%,能检测突变等位基因频率低至0.02%。ctDNA水平与肿瘤大小高度一致性,能反应残余病灶及治疗相关的影像学反应,并且比影像学更加灵敏。而在此基础上的iDES能是从血中检测EGFR激酶区域突变谱敏感性达到92%,特异性达到99.99%,在患者水平其敏感性和特异性分别是90%和96%,此外iDES能监测NSCLC患者105cfDNA中4个ctDNA。我们可以预测iDES-enhanced CAPP-Seq将辅助非侵入性基因分型及在临床中发挥其优势。 参考文献: Nat Med. 2014May;20(5):548-54. An ultrasensitivemethod for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nat Biotechnol. 2016May;34(5):547-55. Integrated digital error suppression forimproved detection of circulating tumor DNA. 来源:生物在线