三代测序之PacBio SMRT技术全解析

测序技术在近几年中又有里程碑的发展,Pacific Biosciences公司成功推出商业化的第三代测序仪平台,让三代测序正式走入我们的视线。与前两代相比,第三代测序有什么不同呢?我们就来详细了解测序界新宠-PacBio SMRT测序平台。

PacBio SMRT测序原理 Pacific Biosciences公司研发的单分子实时测序系统(Single Molecule Real Time,SMRT)应用了边合成边测序的原理,并以SMRT芯片为测序载体。 基本原理如下: 1) 聚合酶捕获文库DNA序列,锚定在零模波导孔底部 2) 4种不同荧光标记的dNTP随机进入零模波导孔底部 3) 荧光dNTP被激光照射,发出荧光,检测荧光 4) 荧光dNTP与DNA模板的碱基匹配,在酶的作用下合成一个碱基 5) 统计荧光信号存在时间长短,区分匹配碱基与游离碱基,获得DNA序列 6) 酶反应过程中,一方面使链延伸,另一方面使dNTP上的荧光基团脱落 7) 聚合反应持续进行,测序同时持续进行

PacBio SMRT测序原理

PacBio SMRT的单分子测序和超长读长是如何实现的?我们重点看一下该技术的两点关键创新:分别是零模波导孔(zero-mode waveguides, ZMWs)和荧光标记在核苷酸焦磷酸链上(Phospholinked nucleotides)。 SMRT Cell含有纳米级的零模波导孔,每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单分子测序,并实时检测插入碱基的荧光信号。ZMW是一个直径只有10~50 nm的孔,当激光打在ZMW底部时,只能照亮很小的区域,DNA聚合酶就被固定在这个区域。只有在这个区域内,碱基携带的荧光基团被激活从而被检测到,大幅地降低了背景荧光干扰。

SMRT Cell和ZMWs

将荧光染料标记在核苷酸的磷酸链而不是碱基上,当核苷酸掺入到新生的链中,标记基团就会自动脱落,减少了DNA合成的空间位阻,维持DNA链连续合成,延长了测序读长。SMRT测序最大限度地保持了聚合酶的活性,是最接近天然状态的聚合酶反应体系。

荧光标记在焦磷酸链上的核苷酸

PacBio SMRT测序建库流程 DNA打断之后,经过末端修复、接头连接、片段筛选、杂交测序引物和聚合酶绑定,即可出库准备上机测序,建库过程无PCR反应。

PacBio SMRT建库流程

PacBio SMRT技术特点