科技服务
scientific research
绝对定量全转录组
产品简介

转录组测序利用高通量测序技术,快速且全面地揭示某一物种特定细胞或组织在某一状态下的几乎所有转录本信息。

转录组测序结果准确性极大的受到文库扩增时PCR偏好性的影响:测序文库的构建过程无法避免使用PCR扩增。在PCR扩增时,所有的文库片段并非以同等速率等量的扩增,扩增速率受到片段长度、GC含量、片段浓度等多方面的影响,容易扩增的片段极大的被富集,一些含量较低的片段或碱基偏好严重的片段甚至完全丢失,最终影响测序结果的准确性。

绝对定量全转录组测序(KC-DigitalRNA-seq)利用数字标签(UMI)技术,追溯每一个文库片段,可实现mRNA、lncRNA和miRNA的绝对化、数字化的精准定量。

 

技术原理

绝对定量转录组测序在文库扩增之前为每一条逆转录的cDNA片段加上唯一的身份标签(Unique Identifier,UMI),也称为数字标签。数字标签会伴随片段扩增、测序、分析的全过程。同一个片段经过PCR扩增出来的产物均带有相同的数字标签,测序完成后利用UMI追溯每一个片段的来源,将相同来源的片段(具有相同的序列和UMI)进行合并,就能准确去除PCR扩增重复,一比一准确还原样本扩增前的原始状态。在此过程中,PCR扩增和测序错误同样可以被纠正:扩增和测序的错误会使得相同UMI标签对应多个不同的序列,那么只需比较这些序列的相似性,即可纠正这些错误。

图 常规转录组测序(左)与绝对定量转录组测序(右)

技术原理详细介绍视频http://seqhealth.cn/view/34.html

 

技术流程

建库方法                                                                                       项目流程                

 

技术优势
  • 专利建库技术:为每一条RNA片段加上身份标签UMI,使测序全程可追溯;并UMI标签去除PCR扩增偏好干扰,还原样本组成;
  • 全面提升转录组测序质量:精确分析表达量和筛选差异表达,还能准确锁定RNA编辑、可变剪接、cSNP位点;
  • 降低建库起始量:100ng即可达到1ug建库同等测序结果,更适合稀少珍贵的样本;
  • 提高重复可靠性:排除PCR扩增偏好,多次重复可靠性高;
  • 适用多种RNA测序:UMI建库及分析技术可适用mRNA、lncRNA、miRNA测序,以及RIP、CLIP、MeRIP等获得的RNA测序。

 

结果展示

实验设计

100ng起始量,分别采用两种方法进行建库测序,在文库PCR扩增步骤选择扩增15个和23个循环。

 

Reads统计

结果说明:

1. KC-digitalRNATruseq两种建库方式的数据重复率均在50%左右,且PCR循环数的增加会造成数据的重复率上升;

2. 利用UMI去重,去掉了约20%左右来源于PCR/测序产生的重复Reads,降低了数据重复率;

3. 利用UMI去重之后,数据重复率仍在40%以上,说明起始cDNA中就存在大量的重复片段。

 

PCR扩增循环次数的影响对比

对同一个样本扩增15个循环和23个循环的测序结果的相关性进行比较:

结果说明:

1. 因为是用同一个样本建库测序,所以相关性越高越好,说明不同PCR循环数对结果的影响越小;

2. 图中红色点为使用Truseq试剂盒的普通RNA-seq测序结果,黑色点为KC-DigitalRNA-seq测序结果;

3. 总体上,KC-DigitalRNA-seq的测序结果相关性更好,说明使用UMI降低了PCR扩增循环次数的影响;

4. PCR对高表达量基因(RPKM>322^5))的影响较小,对低表达量基因(RPKM值<12^0))的影响较大,因为低表达量基因更容易受到PCR扩增偏好性的影响。KC-DigitalRNA-seq对低表达量基因检测的相关性明显优于普通RNA-seq

 

差异基因的比较分析

Control组与Treatment组做相关性分析:

 

对两种测序方鉴定的差异表达基因进行统计:

结果说明:

1. 使用相同阈值(|logFC|>1)筛选差异基因,KC-DigitalRNA-seq鉴定出的差异基因略多于普通RNA-seq,KC-DigitalRNA-seq和普通RNA-seq鉴定的上调基因分别为52265027个,下调基因分别为3109个和2912个(图左);

2. KC-DigitalRNA-seq共鉴定出8335个差异基因, 普通RNA-seq共鉴定出7939个差异基因。其中KC-DigitalRNA-seq鉴定的特有差异基因3061个,普通RNA-seq鉴定的特有差异基因2665个(图右)。

 

对测序筛选的差异表达基因进行qPCR实验验证

选择48个差异表达基因(DigitalRNA-seq特有、RNA-seq特有及共有的差异表达基因各16个)进行qPCR验证,分析qPCR和测序结果的相关性。

结果说明:

1. 左图为普通RNA-seqqPCR实验结果的比较,右图为KC-DigitalRNA-seqqPCR实验结果的比较;

2. 普通RNA-seqqPCR实验结果的相关系数R20.872KC-DigitalRNA-seqqPCR实验结果的相关系数R20.987,可见KC-DigitalRNA-seq测序结果与qPCR结果非常相符,有很高的一致性。

 

KC-DigitalRNA-seq使用不同建库起始量的测序结果比较

分别使用100ng500ng1ug作为建库起始量,并将不同建库起始量的测序结果进行相关性分析。

结果说明:

100ng~1ug建库起始量的测序结果的皮尔逊相关系数关系数R2均在0.97以上。使用100ng起始建库,就能实现与1ug高度一致的测序结果。