科技服务
scientific research
超低起始量Nano UMI MeRIP-seq
产品简介

超微量MeRIP-seqMethylated RNA immunoprecipitation with next generation sequencing,甲基化RNA免疫共沉淀结合高通量测序技术)是在转录组层面研究细胞内mRNA以及LncRNA的甲基化,即m6A(腺嘌呤N6位甲基化)定位的技术。

其基本原理直接针对total RNA进行m6A抗体富集,利用残留的rRNA增加建库RNA起始量,并使用UMI 超低起始量建库方式建库,之后剔除rRNA,二次扩增获得最终的文库。经过测序后,测序数据可以在整个转录组层面揭示RNA甲基化—这种转录后RNA表观修饰的定位,整体状况等信息。

项目流程

 

上图:建库流程

 

上图:实验分析流程

技术优势总结

1.超低建库起始量,样品准备不再难:建库起始量降低一个数量级,只需要1ug106个细胞即可建库,样品准备更轻松;使用Novaseq测序,推荐数据量10G,完整项目周期为50个工作日。

2.数字标签还原真实,避免失真结果。

3.设置Input对照,去除背景干扰。

4.丰富项目积累,无惧困难挑战:康测科技已完成上百个IPChIPRIPCLIPMeRIP)项目,积累了动植物、微生物近50个物种的IP经验,涉及各种类型的蛋白,如组蛋白、转录因子、解旋酶、剪接因子等,不惧复杂组织挑战。

部分结果展示

 

 

A:Reads在转录本上的分布:优秀的MeRIP结果Reads存在3’偏好性;

Bm6A peak在转录本上的分布:m6Apeakstop codon3UTR

有富集;

CmeRIP-seqRNA-seq进行联合分析,鉴定过通过m6A修饰调控的基因。

D:典型的m6A peak在基因上的分布。

案例解读

RNA甲基化m6A修饰调控造血干/祖细胞分化

脊椎动物造血干/祖细胞(HSPC)来源于生血内皮,通过内皮-造血转换(EHT)在主动脉血管底部产生。敲除RNA甲基转移酶Mettl3造成胚胎造血功能发育受损,EHT被抑制,内皮细胞不能分化为HSPCMettl3敲除后,全基因组的m6A水平均下降(MeRIP-seq结果显示,m6A修饰水平下调基因多达4593个,上调仅478个,m6A修饰水平下调的基因可能为Mettl3的调控靶标,GO富集到RNA处理、胚胎发育相关term(图a-d)

正常和敲除Mettl3的胚胎的内皮细胞进行RNA-seq,检测到Mettl3敲除胚胎中2393个基因表达上调。关联分析RNA-seqMeRIP-seq结果,在Mettl3潜在靶标中,680个基因表达显著上调,其中Notch1a是上调最显著的基因之一,同时m6A修饰显著下调(图f),很可能是受m6A调控的HSPC分化关键基因,m6A修饰水平下调,导致m6A介导的mRNA降解途径被抑制、Notch1a表达上调,最终造成造血发育受损。

参考文献:Cui Q, Shi H, Ye P, et al. m6A RNA Methylation Regulates the Self-Renewal and Tumorigenesis of Glioblastoma Stem Cells.[J].Cell Reports, 2017, 18(11):2622.