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scientific research
CAGE-seq
技术简介

真核生物mRNA的成熟需要经历三个主要的加工过程:剪接、5'加帽、3‘加尾;而5‘加帽则是其中第一个加工步骤:在RNA被转录出25-30个碱基就会开始加帽修饰。因此,成熟mRNA的5’末端都带有m7G帽子结构

 

mRNA的5‘ cap具有重要的生物学功能:它一方面可以保护RNA免于5’-3‘核酸外切酶降解,另一方面作为一个锚点为剪接、加尾以及出核募集相关蛋白。而5‘ cap最重要的生物学功能,则是其在翻译起始过程中的作用

eIF4F复合物(包括eIF4A、eIF4E和eIF4G)识别mRNA的帽结构,并通过PABP的作用介导mRNA形成首尾相邻的环状结构,进而招募43S预起始核糖体复合物扫描AUG起始密码子,从而介导翻译的起始。同时,不同的5’ cap位点的使用,意味着基因使用了不同的转录起始位点(TSS)、不同的启动子,以及不同的转录因子的调控。因此对5‘ cap的研究具有重要的生物学价值。

CAGE-seq的应用
  1. 新基因的鉴定;

  2. 基因结构优化;

  3. 转录起始位点鉴定;

  4. 可变启动子鉴定;

  5. 功能转录因子的鉴定;

  6. 双向增强子RNA的鉴定;

  7. 灵敏准确的基因表达定量分析。

CAGE-seq方法综述

CAGE-seq(Cap Analysis of Gene Expression by deep sequencing)是发展出来专门研究mRNA加帽位点的测序技术。其技术原理,是通过高通量测序的方法,对通过不同手段富集到的mRNA 5'序列进行测序,从而获得mRNA的不同起始位点,以及不同起始位点的使用情况。目前已经发展出了至少3大类5’ mRNA的富集方法,如下图所示:

 

 

  1. 亲和纯化:此类方法的核心是对mRNA的5‘ cap结构进行生物素标记,进而对mRNA进行片段化,然后通过亲和纯化的方式富集RNA的Cap段进行建库测序,代表方法为经典的CAGE-seq和RAMPAGE-seq;

  2. 直接连接:此类方法首先对RNA进行去磷酸化处理,将不带cap结构的RNA5‘处理成羟基,然后使用TAP(烟草酸性焦磷酸酶)处理,将CAP结构变成单PO4,然后在RNA的5‘直接进行连接接头,只有由CAP生成5’-PO4的RNA可以发生连接,从而确定RNA的cap;

  3. 链置换:此类方法的核心是利用逆转录酶的末端转移酶活性(TDT,Terminal deoxynucleotidyl transferase)和链置换(template switching)活性,在逆转录体系中加入特定引物,在逆转录至mRNA的cap后,逆转录酶的TDT活性和链置换活性会转换模板使用引物为模板继续逆转录,从而生成测序文库,代表方法为STRT-seq和NanoCAGE-seq;

 

上述三种方法各有优缺点:前两种方法对RNA的需求量大,操作步骤繁琐,成本也高,但准确性高;后面一种方式效率很高,RNA需求量少,但TDT和链置换的特异性较低,因此假阳性较高;

康测产品及其优势

1、nanoCAGE的问题在于没有cap的RNA逆转录之后仍有一定比例会发生TDT,进而链置换生成文库,从测序数据中是无法区分来自CAP的序列和其他来源的序列的,因此会产生一定的假阳性

2、为了解决这个问题,我们对NanoCage的方法进行了改进,其原理如下图:

1)主动对非Cap结构的RNA进行了消解和去除,降低假阳性来源

2)使用连接而非Template switch进行测序接头的添加:只有严谨的GGG:CCC配对连接才能发生,降低了非cap来源TDT-cDNA的使用率,降低假阳性;

3)建库过程中加入UMI分子标签,去除PCR重复以获取更为准确的定量结果(原理点击这里)。

 

服务流程

 

结果示例