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scientific research
lncRNA测序
研究对象

LncRNA-seq是专门检测lncRNA的测序手段吗?

不是的,lncRNA-seq还可以检测全部mRNA和部分circular RNA的表达,但其主要目的是为了检测lncRNA。

 


lncRNA和来源

        LncRNA(Long non-coding RNA,长链非编码RNA )是指长度大于 200 个核苷酸、同时不具备蛋白编码能力的一大类RNA的总称。lncRNA是一个庞大的家族,截止2018年各类RNA数据库、文献报道的人类lncRNA数目已经达到270,044个。数目如此巨大的lncRNA分类是一个大问题,由于lncRNA序列、结构的多样性,目前常用的分类方式,是根据lncRNA的来源分类,主要包括以下几类:

  • lincRNA:基因间区转录出的lncRNA;
  • Intronic lncRNA:基因的内含子区转录出的lncRNA;
  • Exonic lncRNA:外显子区转录出的lncRNA;
  • NATs:基因区转录出的反义RNA;
  • eRNA:增强子区转录出的RNA;
  • Promoter lncRNA:启动子区转录出的RNA

 

 

lncRNA的功能

        虽然数目众多,但lncRNA基因的表达水平远低于蛋白编码基因,同时其表达又具有显著的特征:大多数lncRNA(〜78%)的表达具有组织特异性(mRNA仅为〜19%)、更高的发育阶段特异性,甚至是细胞亚型特异性。这暗示其重要的调控功能。目前的研究发现,lncRNA在表观、转录、翻译甚至翻译后修饰等各个层面都可以调控基因的表达,如下图:

  • 表观遗传学调控: 部分lncRNA可募集染色质修饰蛋白到特定基因组基因座上发挥功能,改变DNA/RNA甲基化状态,染色体结构和修饰状态,进而控制相关基因的表达;
  • 转录体调控:一些lncRNA可作为配体与转录因子结合为复合体,控制基因转录活性;
  • 转录后调控:lncRNA还可直接参与可变剪切,RNA编辑,蛋白翻译与转运等过程中,发挥调控作用;
  • 调控miRNA:lncRNA通过ceRNA机制与miRNA相互作用,调控靶基因的表达调控。

 

 


lncRNA的研究思路

 

        lncRNA的种类、数目太多,调控机制也异常庞杂,因此研究思路也高度多样,需要根据lncRNA的调控机制进行相应的设计,但lncRNA研究的前提,就是功能lncRNA的鉴定:发育过程、癌变前后、特定处理前后,都可能涉及lncRNA表达改变,因此lncRNA-seq就是解决此类问题的最佳工具:

 

 

LncRNA-seq

        LncRNA-seq是为lncRNA的鉴定、表达检测发展出来的测序方法。其技术原理,是对RNA中含量最高的rRNA进行剔除,进而通过磁珠筛选去除含量较高的小型RNA如tRNA、snRNA等,然后对剩下的所有RNA进行建库测序。上述处理之后的RNA中,除了lncRNA外,还包含全部的pre-mRNA、mRNA和部分circular RNA。

 

        因此,lncRNA-seq还可以检测全部mRNA和部分circular RNA的表达。其技术原理如下:

 

 

难点痛点

        LncRNA-seq虽然是目前最全面的RNA测序技术,但是其应用却存在很大的限制---只有少数物种可以进行lncRNA-seq。
问题的核心在于rRNA剔除的步骤。目前的rRNA剔除存在两种主要的技术手段:

  • rRNA的RNase H消化去除;
  • rRNA亲和捕获去除;

        这两种技术,都需要根据目标物种rRNA序列,设计特异性的antisense oligo。虽然rRNA基因是最保守的基因,但物种间仍存在差异,尤其是远源物种的序列差异很大,因此需要针对性的一一设计。这极大限制了LncRNA-seq的应用范围:目前商业化的rRNA剔除试剂盒,仅覆盖十余个动物、植物物种,以及数十种微生物。因此,大部分物种是无法进行LncRNA-seq的,尤其是细菌,由于其RNA缺乏polyA尾,连普通的mRNA-seq都无法完成,这极大限制了RNA-seq的应用。

 

        为此,我们对文献报道的DSN消化技术进行商业化,开发出无物种依赖的rRNA剔除产品

 

        其技术原理,是通过对双链cDNA的变性和重新退火,再使用DSN酶消化双链DNA。该技术利用了DNA退火的动力学性质:浓度越高的 cDNA(rRNA来源)越快重新退火形成双链cDNA;而mRNA、lncRNA来源的cDNA含量很低,无法退火成双链。因此经过DSN处理之后,mRNA、lncRNA的cDNA得以保留,而rRNA的cDNA被消化掉。

 

 

该技术使得非模式动、植物物种,真菌,尤其是细菌的RNA研究成为可能。DSN rRNA剔除产品效果见下方“实测结果”部分。

 

技术优势

 

服务流程

 

        您只需要提供足量的细胞/组织或RNA,我们将根据RNA来源的不同,选择合适的rRNA剔除方案并构建文库!!

 

 

实测结果

DSN rRNA剔除效果

这里展示的是罗非鱼和白色念珠菌两个物种,DSN剔除rRNA后进行RNA-seq的结果。

在2个物种中,rRNA残留的比例都在10%以下;且mRNA reads在基因上的分布很均一。

 

lincRNA-seq分析结果展示

应用案例

部分客户发表文章

  • Di Qu, Wei-Wei Sun, Li Li, Li Ma, Li Sun, Xia Jin, Taisheng Li, Wei Hou and Jian-Hua Wang. Long noncoding RNA MALAT1 releases epigenetic silencing of HIV-1 replication by displacing the polycomb repressive complex 2 from binding to the LTR promoter.D Qu et al.  Nucleic Acids Res (2019) (IF:11.501)

 

  • Yang H, Liu C, Fan H, Chen B, Huang D, Zhang L, Zhang Q, An J, Zhao J, Wang Y, Hao D. Sonic Hedgehog Effectively Improves Oct4-Mediated Reprogramming of Astrocytes into Neural Stem Cells. Mol Ther. 2019. (IF:8.986)

 

  • Zeng, Xi, et al. "Transcriptome Profiling of Lung Innate Immune Responses Potentially Associated with the Pathogenesis of Acinetobacter baumannii Acute Lethal Pneumonia." Frontiers in Immunology 11(2020). (IF:4.848)

 

  • Liu S, Tang Y, Ruan N, et al. The Rice BZ1 Locus Is Required for Glycosylation of Arabinogalactan Proteins and Galactolipid and Plays a Role in both Mechanical Strength and Leaf Color[J]. Rice, 2020, 13(1). (IF:3.912)
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