科技服务
scientific research
circRNA测序
产品简介

环状RNAcircular RNAcircRNA)是最近发现的一类特殊的内源非编码RNA,它大量存在于真核细胞胞质内,主要由pre-mRNA在可变剪接的过程中,将上游exon5’端与下游exon3’端剪接到一起,形成的首尾相接的环状RNA分子。

它常被发现起到miRNA海绵的作用,在细胞生长发育,功能代谢和某些病理反应中发挥重要的调控作用。例如,circRNA可以作为竞争性内源RNAcompeting endogenous RNAceRNA)结合胞内miRNA,通过circRNA-miRNA-mRNA的途径来阻断miRNA对其靶基因的抑制作用。除此以外,circRNA也具有调控其他类型RNA、调节蛋白质活性等功能。

 

技术流程

建库方法                                                                                        项目流程              

 

技术优势
  1. 低至10ug RNA的建库起始量
  2. 采用链特异性建库方法,能更好鉴定circRNA的正反义链来源
  3. 联合miRNA测序数据,研究ceRNA调控机制

 

结果展示

差异表达circRNA MA plot

 

 差异表达基因聚类分析

 

circRNA的靶miRNA预测

 

案例解析

案例一:circRNA+miRNA关联分析探究circMTO1在肝细胞癌中的调控机制

背景:环状RNA(circular RNA,circRNA),也是一种內源非编码RNA,它常起到miRNA海绵的作用,在细胞生长发育,功能代谢和某些病理反应中发挥作用。

circRNA-seq:对7组肝细胞癌(HCC)和癌旁组织样本的circRNA表达量进行分析,筛选得到20个显著差异表达的circRNA,其中6个通过了qPCR验证,circMTO1在HCC组织中为一致性的显著低表达。

circRNA靶基因预测及验证:因为环状RNA主要起RNA海绵的作用,通过跟miRNA结合,通过circRNA-miRNA-mRNA的途径来调控基因表达,所以作者接下来分析了跟circMTO1相关的miRNA。

作者通过miRNA预测软件miRanda预测circMTO1的靶标。选择其中20个与HCC相关的miRNA进行circRNA的RIP实验验证,发现只有miR-9在pull down的RNA中出现特异富集,证明miR-9与circMTO1的特异结合与互作。为了证明两者在细胞内结合,作者还使用了FISH证明两者共定位。

miR-9的靶基因P21是肿瘤抑制因子,circMTO1的沉默或者miR-9的过表达都会显著降低P21的表达量和蛋白水平、影响HCC增殖。这是一条典型的circRNA-miRNA-mRNA调控途径:正常组织中,miRNA可抑制P21,而circMTO1通过吸收miR-9使肿瘤抑制因子P21上调,发挥抗肿瘤作用,最终导致HCC增殖抑制;肝癌组织中,由于circMTO1低表达,miR-9可以发挥作用,P21的表达被抑制,促进了HCC增殖和肝癌发生。

 

参考文献

Han D, Li J, Wang H, et al. Circular RNA MTO1 acts as the sponge of miR-9 to suppress hepatocellular carcinoma progression.[J]. Hepatology, 2017.

 

案例二:circRNA测序揭示circHIPK3吸收多种miRNA调控细胞增殖

环状RNAcircRNA)是一类广泛存在于真核生物中的内源性RNA,可能在基因表达调控方面起到一定作用。但是,环状RNA在人体中如何发挥调控作用仍未阐明。

该研究中,作者对六种正常组织和七种癌变组织样本通过去除核糖体的方式进行了RNA测序,并发现了27000circRNA,其中大多数的circRNA在正常组织和癌变组织中差异表达。作者进一步研究了来源于HIPK3基因Exon2circRNA,并将其命名为circHIPK3circHIPK3的沉默,而非HIPK3 mRNA的沉默能够明显抑制人细胞的生长。荧光素酶筛选实验显示,circHIPK3能像海绵一样吸收9miRNA18个潜在结合位点。而且,circHIPK3直接结合miR-124并抑制miR-124的活性。这项研究证明来自mRNA前体的circRNA具有调控人细胞的作用。

http://seqhealth.cn/image/circRNA_sequencing/circRNA-seq-2.png

图:人的circRNA在基因组的来源统计图:80%以上的circRNA来自外显子,小部分来自内含子、lncRNA和反义区(a);不同正常组织中的circRNA聚类分析热力图(b);进一步研究发现circHIPK3是基因HIPK3产生的主要circRNA,基因HIPK3产生五种circRNA,其中circHIPK3包含基因HIPK3的第二外显子(c)。

 

参考文献

Zheng Q, Bao C, Guo W, et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs[J]. Nature Communications, 2016, 7(11215).