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BS-seq(DNA甲基化测序)
DNA甲基化

DNA甲基化和去甲基化

        DNA甲基化是将一个甲基基团添加到DNA分子的过程。DNA的四个碱基中的两个,胞嘧啶和腺嘌呤,可以被甲基化,最普遍也是研究最深入的胞嘧啶第5位的甲基化,5mC。

        5mC在真核生物和原核生物中均很普遍,但甲基化程度在物种之间差异很大:拟南芥中约14%的胞嘧啶甲基化,小鼠中约7.6%,绒泡菌中4%至8%,大肠杆菌2.3%,在果蝇0.03%,果盘杆菌中为0.006%,而在秀丽隐杆线虫真菌中则几乎不发生甲基化。

        5mC甲基化是依赖胞嘧啶的所在的环境序列的,主要有三种序列环境:CG(或CpG),CHG或CHH。在哺乳动物中,虽然非CpG甲基化在胚胎干细胞、造血祖细胞中被报道过,DNA甲基化几乎只存在于CpG二核苷酸中;但是在植物中,尤其是植物特异的rdDM(RNA介导的DNA甲基化)过程中,胞嘧啶的甲基化则不依赖该序列环境,CG、CHG和CHH都可能维持很高水平。

        DNA的甲基化和去甲基化处在一个动态平衡中,都是由酶来催化的:

  • DNA甲基化是由DNMT(DNA甲基化转移酶)家族成员催化和维持的,其中DNMT3负责催化新的甲基化产生,而DNMT1则维持已有胞嘧啶的甲基化;
  • DNA去甲基化则是一个复杂的过程,TET家族蛋白首先氧化5mC产生5hmC,进而是5fC和5caC,最终被TDG糖苷酶识别并切割,形成无碱基AP位点,并通过碱基切除修复(BER)生成未甲基化的胞嘧啶;

 

DNA甲基化介导的基因表达调控

        DNA甲基化和去甲基化的动态平衡控制着生物体中基因表达的强度。甲基化可以改变DNA片段的活性,当位于基因启动子中时,DNA甲基化通常起到抑制基因转录的作用。在哺乳动物中,DNA甲基化对于正常发育至关重要,并且与许多关键过程相关,包括基因组印迹,X染色体失活,转座因子阻抑等,DNA甲基化水平的异常会导致疾病发生。
 

DNA甲基化可以直接或间接调控基因的表达:

  • 直接的,DNA甲基化可以直接阻止转录因子对启动子的识别,从而调控基因的转录;
  • 间接的,DNA甲基化可以招募MBD蛋白(methyl-CpG-binding domain protein),封闭转录因子的结合位点,从而调控基因的转录;
  • 间接的,DNA甲基化可以通过MBD蛋白介导与组蛋白修饰互作,产生抑制性的染色质结构,通过改变染色质结构来调节基因表达。

 

 

 

BS-seq

亚硫酸盐转换(Bisulfite conversion)

        DNA中的胞嘧啶,在使用亚硫酸盐处理时,会发生脱氨基反应,最终从胞嘧啶(C)转换成尿嘧啶(T);如果胞嘧啶发生了5mC甲基化修饰,这个转换则无法发生,处理之后仍然是胞嘧啶。通过上述原理,对基因组DNA进行亚硫酸盐转换,建库和高通量测序,通过对测序Reads中C-T转换进行分析,即可在单碱基分辨率上检测全基因组甲基化修饰的状态。

 

 

BS-seq建库

        传统的BS-seq文库构建过程如下图左所示:首先将DNA进行片段化、末端修复,连接甲基化修饰的接头(该修饰可以保证接头在BS处理时不发生C-T碱基转换,以维持下游PCR的引物配对);进而进行BS转换,将转换之后的DNA进行PCR扩增,即可以得到C-T转换之后的文库。这种方式存在很大的缺陷:亚硫酸盐转化的同时会伴随的DNA降解,降解发生在去嘌呤化的过程中,导致DNA的随机断裂。充分的转化可能导致约90%的DNA降解。因此该方法需要较大的DNA起始量,同时文库会存在很强的偏好性。

        为了解决这个问题,先后出现了多种“转化后建库”的测序方法,如:

  • Accel-NGS的PBAT(Post Bisulfite Adapter Tagging);
  • Truseq的PBRT(Post bisulfite Random Tagging);
  • 未商业化的SPLAT(SPlinted Ligation Adapter Tagging);

这些方法由于采用的都是BS转化后建库,因此BS转化过程中降解产生的DNA片段可以被利用,因此DNA起始量大大降低,文库的偏好性也大大降低。

 

应用场景

        DNA甲基化变化在几乎所有的生物学过程中都发生,因此BS-seq应用场景极其广泛,常见的应用如下:

  • 发育过程中DNA甲基化变化及其介导的基因表达变化;
  • 特定生物学变化(如癌变)前后DNA甲基化变化及其介导的基因表达变化;
  • 特定对照-处理前后DNA甲基化变化及其介导的基因表达变化;
  • 研究非编码RNA介导的DNA甲基化修饰及其功能;

        DNA甲基化作为研究三大表观调控因素之一的手段,通常与组蛋白修饰染色质构象以及基因表达一起联合使用。

服务流程

您只需要提供如下所述的细胞、组织或DNA,我们将完成所有的实验及分析!

 

 

产品优势

康测BS-seq采用post-bisulfite adapter ligation的技术!

  • 高灵敏度(10 ng)
  • 无模板DNA损失
  • 无偏好性
  • 更均一的覆盖度
  • 稳定性(10 vs 300 ng)

 

图1:康测BS-seq比常规BS-seq具有更均一的覆盖度

 

图2:同一DNA分别使用10 ng ~ 300 ng进行BS-seq,对不同起始量的数据中甲基化位点的相关性进行分析,发现从10ng到300ng样品间相关性极高。

 

结果展示

 

 

 

 

 

 

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