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scientific research
MeRIP测序 (RNA甲基化测序)
产品简介

m6A甲基化修饰在基因表达调控、mRNA剪接、RNA编辑、RNA稳定性、控制mRNA寿命和降解、介导环状RNA翻译等方面扮演重要角色。

甲基化RNA免疫共沉淀结合高通量测序(Methylated RNA Immunoprecipitation with Next Generation SequencingMeRIP-Seq)是研究细胞内转录组表观修饰的最新技术。这项技术通过使用N6-甲基腺嘌呤抗体富集高甲基化的RNA片段,然后结合高通量测序,在全转录组范围内研究发生甲基化的RNA区域,从而比较不同细胞、组织、样本间的RNA甲基化修饰模式的差异,可帮助解决细胞分化、生物发育、疾病发生发展、热休克反应等生物学问题。

康测科技将数字标签UMI技术应用于MeRIP-seq,推出绝对定量MeRIP测序产品,该产品将MeRIP富集的RNA添加数字标签UMI,构建定量测序文库,实现超低起始量(20ug)的绝对定量MeRIP测序。

 

技术流程

                 建库方法                                                                           项目流程                                               

 

技术优势
  1. 超低建库起始量:建库起始量低至20~50ug RNA,5X107细胞可建库,样品准备更加轻松。
  2. 团队实力:核心团队由来自加州大学圣地亚哥分校(UCSD)、武汉大学、华中农业大学的博士后组建,成员已在NatureCellMolecular CellNat. Struct. Mol. Biol.Proc Natl Acad Sci USA等国际顶级期刊发表文章十余篇。
  3. 项目经验:公司已完成1000多项ChIP-seqRIP-seqCLIP-seqMeRIP-seq实验及测序分析服务,包括动物(人、小鼠、大鼠、人、羊、牛、鸡、猪、鱼等)、植物(拟南芥、水稻、棉花、小麦、土豆、番茄、苹果、葡萄、白菜、苜蓿二穗短柄草等)、微生物(大肠杆菌、禾谷镰刀菌、弧菌等)50余物种的IP项目,项目整体成功率约95%
  4. 严格质检:IP抗体进行严格的质检和效价评估,对实验体系耐心优化,并提供详细的质检报告,可供文章发表使用。
  5. 数据分析:自主开发的分析流程,特有的Peak calling技术,可提供个性化、多组学关联分析,帮助解析m6A的调控机制。

 

结果展示

 

A)reads在基因上的覆盖情况:在peak区域,IP的reads覆盖度高于input(没有使用抗体富集的对照),(横轴为基因位置,左边纵轴为覆盖度);           

B)Peak在基因5'UTR、CDS、3'UTR区域的分布;

C)基于差异m6A基因和差异表达的mRNA的联合分析(绿色三角表示显著差异的m6A修饰基因,黄色圆圈表示显著差异表达的基因,橙色五角星表示同时显著差异m6A修饰和显著差异表达的基因);

D)Peak的motif分析。

 

技术解读

数字标签(UMI)建库是康测科技自主开发的绝对定量建库技术,通过数字标签追溯每一个文库片段,准确还原样本原始状态,实现绝对化、数字化的精准定量。UMI建库方法应用于RIP测序,可以降低建库起始量、解决RIP测序中的碱基偏好性问题、提高input和IP检测准确度,将RIP测序准确度提升到新的高度。

RNA的修饰通常具有选择性的,因此MeRIP测序文库碱基平衡性通常不佳,碱基不平衡导致PCR扩增偏好,并影响文库构建和最终的测序分析结果。UMI正是解决PCR扩增偏好的方法:

利用UMI追溯reads来源和去重

如上图所示,UMI建库测序方法在文库扩增之前为每一条逆转录的cDNA片段加上唯一的身份标签——UMI,UMI会伴随片段扩增、测序、分析的全过程。同一个片段经过PCR扩增出来的产物均带有相同的数字标签,测序完成后利用UMI追溯每一个片段的来源,将相同来源的片段(具有相同的序列和UMI)进行合并,就能准确去除PCR扩增重复,一比一准确还原样本扩增前的原始状态。

UMI避免了PCR扩增偏好性,因此,在建库起始量较低的情况下,可增加PCR文库扩增循环次数,结合UMI去重纠错,在不影响准确性的前提下使建库起始量大大降低,20~50ug RNA即可轻松建库。

 

案例解析

RNA甲基化m6A修饰调控造血干/祖细胞分化

脊椎动物中,造血干/祖细胞(HSPC)来源于生血内皮,通过内皮-造血转换(EHT)方式在主动脉血管底部产生。Mettl3RNA甲基转移酶,敲除Mettl3造成胚胎造血功能发育受损,EHT受到抑制,内皮细胞不能分化为HSPC HSPC相关marker表达量显著减少。

Mettl3敲除后,Mettl3蛋白表达量和全基因组的m6A水平均下降(MeRIP-seq结果显示,m6A修饰水平上调的基因478个,下调的基因多达4593个),这些m6A修饰水平下调的基因可能为Mettl3的调控靶标,且GO富集到RNA处理、胚胎发育相关term,说明m6A修饰与发育有关。

 

选取受精后28小时的正常胚胎和敲除Mettl3的胚胎的内皮细胞进行RNA-seq,检测到Mettl3敲除胚胎中2393个基因上调,1386个基因下调,上调基因显著富集到Notch和血管发育term。关联分析RNA-seqMeRIP-seq结果,在4593Mettl3潜在靶标中,462个基因显著下调,680个显著上调,且上调基因与生血内皮发育显著相关。在上调基因中,作者筛选到Notch1a表达量显著上调,而m6A修饰几乎没有,很有可能是受到m6A修饰调控的HSPC分化关键基因。作者还发现Mettl3敲除胚胎中Notch1活性显著上升。

调控途径:RNA甲基转移酶Mettl3催化→ Notch1a的m6A修饰→ Notch1活性→造血发育、EHT

 

参考文献

Cui Q, Shi H, Ye P, et al. m6A RNA Methylation Regulates the Self-Renewal and Tumorigenesis of Glioblastoma Stem Cells.[J].Cell Reports, 2017, 18(11):2622.