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RIP测序
产品简介

RIP-seqRNA immunoprecipitation and high-throughput sequencing)是RNA免疫沉淀与高通量测序结合的技术,它通过免疫沉淀目标蛋白来捕获蛋白体内结合的RNA。将捕获的RNA进行高通量测序,可获得RNA结合蛋白(RBP)在体内与众多RNA靶标的结合模式,并对其结合强度进行精确定量,最终通过分析目的蛋白在体内结合RNA的动态变化,阐述出目的蛋白对基因表达调控的分子机制。

RIP-seq技术可绘制全转录组范围的RNA和RBP(RNA结合蛋白)相互作用图谱,解析“Argonaute(Ago)-miRNA-mRNA”三者的互作。但是RIP-seq并不局限于miRNARBP的传统研究,lncRNA和多种蛋白互作、广泛的参与生物学过程,RIP-seq用于发现RBPlncRNA的互作网络也为lncRNA的细胞机制和疾病的发生、发展研究提供了新的线索和方向。

康测科技将数字标签UMI技术应用到RIP-seq,推出UMI RIP-seq产品,该产品将RIP富集的RNA添加数字标签UMI,构建定量测序文库,实现绝对定量RIP测序。

 

技术流程

建库方法                                                                           项目流程                           

 

技术优势
  1. 团队实力:核心团队由来自加州大学圣地亚哥分校(UCSD)、武汉大学、华中农业大学的博士后组建,成员已在NatureCellMolecular CellNat. Struct. Mol. Biol.Proc Natl Acad Sci USA等国际顶级期刊发表文章十余篇。
  2. 项目经验:公司已完成1000多项ChIP-seqRIP-seqCLIP-seq实验及测序分析服务,包括动物(人、小鼠、大鼠、人、羊、牛、鸡、猪、鱼等)、植物(拟南芥、水稻、棉花、小麦、土豆、番茄、苹果、葡萄、白菜、苜蓿二穗短柄草等)、微生物(大肠杆菌、禾谷镰刀菌、弧菌等)50余物种的IP项目。
  3. 高成功率:组蛋白ChIP-seq成功率接近100%,转录因子ChIP-seq成功率超过95%RIP-seqCLIP-seq成功率接近95%
  4. 严格质检:IP抗体进行严格的质检和效价评估,对实验体系耐心优化,并提供详细的质检报告,可供文章发表使用。
  5. 数据分析:自主开发的分析流程,特有的Peak calling技术,可提供个性化、多组学关联分析,帮助解析目的蛋白调控机制。

 

结果展示

A)IP质检结果(IP-上清:抗体免疫沉淀上清中目的蛋白检测,Input:样品裂解液中目的蛋白检测,IP:抗体富集目的蛋白检测,IgG:IgG富集目的蛋白检测);            

B)reads在所有基因功能区域的累积分布(上)和每个基因上reads的分布情况(下),红色代表覆盖度深;

 

C)Peak在基因各功能区的分布统计;

D)reads在基因上的覆盖情况:在peak区域,IP的reads覆盖度高于input,  (横轴为基因位置,左边纵轴为覆盖度)。

 

技术解读

数字标签(UMI)建库是康测科技自主开发的绝对定量建库技术,通过数字标签追溯每一个文库片段,准确还原样本原始状态,实现绝对化、数字化的精准定量。UMI建库方法应用于RIP测序,可以降低建库起始量、解决RIP测序中的碱基偏好性问题、提高inputIP检测准确度,将RIP测序准确度提升到新的高度。

RNA结合蛋白对RNA序列是有选择性的,会倾向于结合具有某些特征的序列,因此RIP测序文库碱基平衡性通常不佳,导致PCR扩增偏好比转录组测序更为严重。

利用UMI追溯reads来源和去重

如上图所示,UMI建库测序方法在文库扩增之前为每一条逆转录的cDNA片段加上唯一的身份标签——UMIUMI会伴随片段扩增、测序、分析的全过程。数据分析前,我们先根据数字标签追溯reads来源,同一个片段经过PCR扩增的产物均带有同一UMI,我们根据UMI便能精确追踪reads的来源,对那些由于PCR扩增偏好等种种原因产生的异常扩增的reads归类和去重,再以真实的序列丰度进行Peak calling,达到绝对定量检测。

UMI避免了PCR扩增偏好性,因此,在建库起始量较低的情况下,可增加PCR文库扩增循环次数,结合UMI去重纠错,在不影响准确性的前提下使建库起始量大大降低。

技术详解:RIP-seq如何准确锁定目的蛋白结合的RNA?

 

案例解析

SRSF6调控可变剪接促进结直肠癌肿瘤发展

剪接因子SRSF6在结直肠癌中上调,且能促进癌细胞增殖、转移和侵袭,与不良预后相关.

结直肠癌细胞系SW620中的SRSF6敲除后,mRNA测序筛选差异可变剪接事件1158个,可变剪接事件为盒式外显子(CA),包括外显子跳跃和保留,SRSF6对外显子的跳跃和保留均有调控作用。这些可变剪接事件与细胞粘附分子结合途径、细胞骨架蛋白结合相关。

同时使用RIP测序寻找SRSF6结合的转录本,并关联分析SRSF6调控的可变剪接体和SRSF6结合的转录本,筛选到ZO-1(表达重要的细胞粘附分子)的23号外显子保留的可变剪接体在SRSF6敲除后显著增加,且23号外显子含有motif序列UGGACRIP实验验证SRSF6与该motif特异性结合。

在结直肠癌中,SRSF6表达上调,SRSF6ZO-123号外显子特异结合并引起外显子跳跃,促进结直肠癌的发展。

mRNA-seqRIP-seq关联分析筛选SRSF6调控关键基因

 

参考文献

Wan L, Yu W, Shen E, et al. SRSF6-regulated alternative splicing that promotes tumour progression offers a therapy target for colorectal cancer[J]. Gut, 2017:gutjnl-2017-314983.

 

更多信息

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