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T细胞受体(TCR)测序
产品简介

T细胞受体库测序(T cell receptor repertoire sequencingTCR-Seq)是以生物信息学(Bioinformatics)全面高速分析高通量测序技术(High-throughput sequencingHTS)检测靶向扩增后的T细胞抗原识别决定性表面分子,即T细胞受体(T cell receptorTCR)多样性的检测技术,用以揭示机体在生理和病理状态下T细胞介导的细胞免疫应答(T cell-mediated immune response)状态改变。

T细胞介导的细胞免疫应答过程中,抗原呈递细胞(antigen-presenting cellAPC)摄取抗原(Ag)、消化形成抗原-MHC分子复合物,并呈递给T细胞。T细胞通过自身T细胞受体β链中V-D-J基因重排后的CDR3β参与抗原识别。

TCR的基因由可变区V、多变区D、结合区J和恒定区C四部分基因片段组成,形成互补决定区complementarities determining region, CDR和间隔的4个骨架区framework region, FR),基因结构如下图所示。在T细胞发育过程中CDR12FR区域相对保守,CDR3区由VDJ 进行重排而形成具有功能的TCR编码基因(T细胞克隆),由于V65~100种)、D2种)、J13种)基因片段本身具有多样性,此外,由于在重排的过程中,在VDD-J的连接区经常有非模板的核苷酸的随机插入或删除,进一步增加了CDR3区的多样性。这种基因片段连接的不准确性使TCR的表达呈多样性,以识别各种不同的抗原。

TCR基因结构,左:α链基因结构,右:β链基因结构

 

TCR-seq常用于评价各种免疫相关疾病和遗传性突变引起的某个物种所有T细胞或特定T细胞激活介导的细胞免疫反应中TCR基因重排碱基序列,以及各序列的丰度,用于研究不同T细胞克隆的转录情况和相互间关系,从而揭示更深层次的T细胞功能特异性,继而解释免疫应答机制、免疫耐受原因,免疫调节形式等相关生命现象。

TCR测序的应用方法包括:(1)肿瘤免疫治疗后的监测和治疗指导,(2)抗感染免疫治疗效果和耐受性评估,(3)移植排斥反应中急性排斥反应的预测和干预指导,(4)自身免疫疾病的临床试验和科学研究,(5)感染性和神经可塑性疾病的生物标志物。

 

技术流程

建库方法                                                                                        项目流程          

 

技术优势
  • 检测TCR的RNA序列。与DNA分析相比,可以更为全面和准确地获得某一状态下TCR的多样性信息。
  • 基于5’RACE的方法。5’RACE相较于MPCR测序方法,可以检测到更多的V-J pairing的多样性,同时具有更低的偏好性和较高的准确性。
  • 数字标签(UMI)技术帮助绝对定量。通过UMI标签去除PCR扩增重复、排除PCR偏好性影响,准确分析TCR克隆的丰度,实现绝对定量。
  • 引入校准机制,准确分析TCR的多样性。TCR的高度多样性使得其对测序数据错误极为敏感,PCR和测序错误都可能被误认为序列的突变或重排,因此必须加入校准机制。UMI技术除了实现准确定量,还可纠正PCR和测序错误,锁定真实序列。
  • PE150和PE250测序可选:PE250测序完整覆盖TCR全长,同时检测CDR1/2/3,全面研究CDR1/2对MHC的亲和力影响;PE150测序,靶向CDR3区,测序价格更为经济实惠。

 

结果展示

V-J基因对使用频率分布图

     

   CDR3编码产物长度分布                                               CDR3编码产物motif分析    

           

  1. Top100 TCR重排序列分布

  

 

案例解析

TCR测序发现肿瘤组织中TCR多样性降低

通过TCR-seq获得α链和β链全长序列信息,发现大部分细胞的TCR α链和β链都是唯一的(unique)。拥有一对完全一样的α链和β链可能来源于同一祖细胞,α-β链配对模式为3个以上细胞共有的情况,作者将其定义为扩增克隆(clonal)。

正常组织和外周血中发现的克隆TCR只占总CD8+T细胞的10%左右,而在肿瘤组织中,该比例高达约30%。与外周血或癌旁组织相比,肿瘤组织CD8 +T细胞的TCR克隆要高得多,在调节T细胞中也发现了类似的富集现象,这可能是由于肿瘤病灶处的T细胞被激活并增殖导致的。

肝癌肿瘤组织中,有两个甚至多个克隆TCRT细胞比例升高

 

肿瘤微环境内的T细胞易于发生耗竭或调节T细胞发生抑制,在肝细胞癌(HCC)肿瘤微环境中的肿瘤浸润细胞,效应CD8+T细胞更少,而耗竭细胞更多。且越是晚期的患者,T细胞的耗竭趋势越明显。克隆的T细胞群(含有4个以上的克隆细胞)也更多的表现出耗竭趋势。

 

参考文献

Zheng C, Zheng L, Yoo J K, et al. Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing.[J]. Cell, 2017, 169(7):1342-1356.