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B细胞受体(BCR)测序
产品简介

B细胞受体(B cell receptorBCR)是 B 细胞抗原识别决定性表面分子,BCR的重链heavy chainH65~100种可变区(VH)、2种多变区(DH)、6种结合区(JH)和恒定区(CH)四部分基因片段组成;轻链(light chainL由可变区、结合区和恒定区三部分基因片段组成,基因结构如图1所示。发育过程中的B细胞在重组酶(RAG1RAG2)作用下,形成了多样性高达 1~2×1011BCR同时,由其形成互补决定区(complementarities determining regionCDR):CDR1CDR2CDR3氨基酸序列的多样性,特别是编码CDR3的基因,由于其位于轻链VJ或重链VDJ片段的连接处,可以通过V(D)J的重排和(或)两个基因片段的连接间丢失或插入数个核苷酸(图2),进一步增加BCR的多样性,而形成具有功能的BCR编码基因(B细胞克隆)。此外,在BCR各基因片段重排完成或抗原刺激后,体细胞高频突变也会造成的BCR多样性。

BCR测序通过高通量测序技术检测靶向扩增后的BCR重链和轻链,全面解析BCR基因重排碱基序列,以及各序列的丰度。

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BCR-seq常用于评价各种免疫相关疾病和遗传性突变引起的某个物种所有B细胞或特定B细胞激活介导的细胞免疫反应中BCR基因重排碱基序列,以及各序列的丰度,用于研究不同B细胞克隆的转录情况和相互间关系,从而揭示更深层次的B细胞功能特异性,继而解释体液免疫应答耐受以及高频突变在B细胞应答识别抗原异常等相关生命现象。

BCR测序的应用方向包括:(1)孤立性IgA缺乏症等原发性免疫缺陷病人体细胞突变筛查,(2)自身免疫病(SLE,多发性硬化,I型糖尿病)治疗指导及其过程中病程监测,(3)感染性疾病,恶性肿瘤药物治疗效果和耐受性评估,(4)移植排斥(transplant tolerance)反应中耐受,排斥反应的预测和干预指导。

 

技术流程

 建库方法                                                                                      项目流程         

技术优势
  • 检测BCR的RNA序列。与DNA分析相比,可以更为全面和准确地获得某一状态下BCR的多样性信息。
  • 基于5’RACE的方法。5’RACE相较于MPCR测序方法,可以检测到更多的V-J pairing的多样性,同时具有更低的偏好性和较高的准确性。
  • 数字标签(UMI)技术帮助绝对定量。通过UMI标签去除PCR扩增重复、排除PCR偏好性影响,准确分析BCR克隆的丰度,实现绝对定量。
  • 引入校准机制,准确分析BCR的多样性。TCR的高度多样性使得其对测序数据错误极为敏感,PCR和测序错误都可能被误认为序列的突变或重排,因此必须加入校准机制。UMI技术除了实现准确定量,还可纠正PCR和测序错误,锁定真实序列。
  • PE150和PE250测序可选:PE250测序完整覆盖BCR全长,同时检测CDR1/2/3,全面研究CDR1/2对MHC的亲和力影响;PE150测序,靶向CDR3区,测序价格更为经济实惠。

 

结果展示

VJ基因使用频率热图

 

CDR3长度分布图

   

BCR重链亚型转换进化树示意图 

 

案例解析

BCR测序发现BCR多样性为B-ALL病人诊断到持续性复发过程提供病情指导

文章作者分离了健康人和B细胞急性淋巴母细胞白血病(B-cell acute lymphoblastic leukemiaB-ALL)患者的骨髓(BM)细胞和外周血单个核细胞(PBMC,通过MPCR扩增后BCR测序获得H链和L链基因全长序列信息。

通过比较发现:相比于健康人,B-ALL患者的体细胞高突变和次级重排引起较高的BCR克隆复杂性;B-ALL病人的病程(BM day 0~1241PB day 0~944)与BCR克隆数量具有显著的相关性,该结果得到RT-qPCR定量结果验证(图1)。此外,体细胞高突变和次级重排引起B-ALL病人较高的BCR克隆复杂性和多样性可以用于B-ALL的亚克隆组成的跟踪。

图 1

图 2

因此,BCR-seqB-ALL病人在起始化学治疗中存活的大量的克隆B细胞提供检测信息,同时为固有化学药物耐受和后期不充足治疗提供新的指导作用,也为全抗性克隆的出现提供及时的指导意见(图2)。

 

参考文献

Bashford-Rogers, R. J., et al. (2016). "Eye on the B-ALL: B-cell receptor repertoires reveal persistence of numerous B-lymphoblastic leukemia subclones from diagnosis to relapse." Leukemia 30(12): 2312-2321.