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B细胞受体(BCR)测序
BCR

        B细胞受体(BCR)是B细胞表面上的跨膜蛋白,由形成I型跨膜受体蛋白的免疫球蛋白分子组成,通常位于这些淋巴细胞的外表面。BCR通过生化信号传导和从免疫突触中物理获取抗原,从而控制B细胞的活化。B细胞能够通过BCR识别、结合和内吞抗原,并最终进行抗原递呈。成熟的BCR是一个由重链和轻链组成的四聚体,人类基因组中有7种BCR基因:

  • 重链BCR包括IgA、IgD、IgE、IgM和IgG,由可变区(V)、多变区(D)、连接区(J)和恒定区(C)四部分基因片段组成(VDJC);
  • 轻链BCR包括IgK和IgL,缺少多变区D,由三个基因片段组成(VJC);

重链和轻链相互搭配,两条相同重链BCR和两条相同轻链BCR形成异源四聚体,组成完整的BCR。

 

BCR基因是人类基因组中复杂度很高的基因,也是变异程度很高的基因。人大概有1~2x1011种表达不同的BCR。这个复杂度主要源自3个因素:

  • 组成的多样性:成熟BCR的VDJC/VJC结构,是通过复杂的重组生成的。BCR的重链有65~100种V基因片段、2种D基因片段和6种J基因片段,BCR重组时需要从上述三种片段中各选一个,这赋予了BCR高度的多样性;
  • 连接的机动性:在重排的过程中,在V-D及D-J的连接区经常有非模板的核苷酸的随机插入或删除,进一步增加了CDR3区的多样性;
  • 体细胞突变:在BCR各基因片段重排完成之后,其V区基因也可发生突变,而且突变频率较高。

 

        BCR-seq常用于检测各种免疫相关疾病,遗传性突变引起的BCR基因重排、丰度变化,用于解释体液免疫应答机制。BCR测序的应用方向包括:

  • 原发性免疫缺陷病人体细胞突变筛查;
  • 自身免疫病(SLE,多发性硬化,I型糖尿病)治疗指导及其过程中病程监测;
  • 感染性疾病,恶性肿瘤药物治疗效果和耐受性评估;
  • 移植排斥(transplant tolerance)反应中耐受,排斥反应的预测和干预指导;
  • 抗体筛选

 

BCR-seq

BCR-seq是为检测BCR多样性发展出来的测序技术,和TCR-seq一样,目前有两大主流技术:多重PCR和5' RACE。两种技术的原理如下图所示,技术优劣势如下表所示:

        上述两种技术都有两个共同的问题:PCR重复引入的定量准确性问题和PCR/测序扩增引入的假阳性BCR问题。

  • 不同BCR之间扩增效率无法一致,因此不同BCR扩增时会不同程度的引入重复BCR分子,给定量带来问题;
  • BCR复杂度高,不同BCR之间可能只有少数碱基差异;PCR/测序过程中引入碱基错误,在没有纠错机制的情况下,会被当成新的BCR处理,造成假阳性;

 

 

康测方案

        为解决上述BCR-seq中的技术问题,康测开发出“绝对定量BCR-seq”测序技术,其原理为在扩增偏好性更低的5' RACE技术基础上,引入我公司UMI/UID数字标签纠错技术,其原理如下图所示:

  • 多物种:我们可针对不同物种,开发BCR-seq检测技术;
  • 完整BCR检测:该技术使用5’RACE技术原理,可以获得BCR的完整序列,全面研究CDR1/2对MHC的亲和力影响;
  • PCR偏好性低:该技术使用5’RACE技术原理,相较于mPCR具有更低的偏好性;
  • 定量准确:通过引入UMI数字标签,进一步去除PCR扩增重复和测序重复、彻底排除重复引入的定量问题,准确还原BCR克隆的丰度;
  • 无假阳性:通过引入UMI数字标签,多序列比对校正PCR和测序错误,去除假阳性BCR;

 

服务流程

您只需要:

  • 确定检测的BCR链;
  • 提供足量的B细胞、组织或全血;
  • 我们将完成RNA提取、建库、测序和分析的全部工作;

 

 

实测结果

由于BCR-seq和TCR-seq为相同技术原理,此处结果为TCR-seq测试结果~~


UMI/UID去重后,TCR reads由900万降低到200万,去除了600万由于PCR过度扩增引入的重复Reads;

UMI/UID纠错后,TCR 种类由99万降低到63万,去除了1/3的假阳性克隆

 

UMI/UID去重、纠错前后,TCR复杂度、种类、含量的变化

UMI/UID去重、纠错前后,对两个重复样本的检测,罕见克隆鉴定灵敏度从千分之一提高到万分之一

经测试,我们的TCR-seq检测到的TCR含量可以在10-1 ~ 10-4范围内保持线性

 

 

 

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