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scientific research
绝对定量16S rDNA测序
产品简介

细菌rRNA(核糖体RNA)按沉降系数可分为3种,分别为5S16S以及23S rRNA16S rRNA为核糖体RNA的一个亚基,16S rDNA即编码该亚基的基因。16S rDNA序列包含10个保守区域和9个可变区域,保守区在细菌间差异不大,高变区具有属或种的特异性。对V4可变区进行测序,可对环境(如土壤、水源、皮肤、肠道等)的微生物多样性进行分析。获得的物种分类、物种丰度、种群结构、系统进化、群落比较等信息对环境中微生物组成及进化、微生态研究有重要指导作用。

康测科技研发的KC-Digital-16S rDNA测序产品,在扩增前对体系中存在的每一个DNA分子添加唯一的身份标签(Unique Identifier,UMI),在扩增、测序后对数字标签进行计数,可以完全去除PCR扩增的偏好性,实现数字化精确定量。同时还可准确过滤扩增、测序过程产生的错误,大大提高OTU分类的分辨率,实现对细菌株系进行鉴定。有助于对细菌突变频率、菌群组成的变化机制等进行深入研究。

 

技术流程

建库方法                                                                                         项目流程                     

 

技术优势
  1. 自主研发的建库技术,使用UMI标签,实现准确纠错和精确定量,精确还原物种丰度和菌群结构
  2. 提高OTU分类阈值,达到不仅是种属、甚至株系的高分辨率
  3. 帮助对细菌突变频率、菌群组成的变化机制等进行更深入的研究

 

结果展示

基于分类等级树的组间差异分类单元展示                                    Krona的分类学组成信息交互展示               

 

对3组共9个样品分别使用普通16S rDNA测序和绝对定量16S rDNA测序,进行相关性和聚类分析。

 

结果说明:

普通16S rDNA测序无法区分A组和B组样品,绝对定量16S rDNA测序能将ABC组内的所有样品较好的聚类,组间差异显著,说明该方法更能反映样品真实分组情况,且样品重复性效果较好。(Pearson相关系数表示两个样品间线性相关强弱的程度,绝对值越大表明相关性越强。)

 

案例解析

肠道寄生虫感染缓解过敏性哮喘

作者发现肠道寄生虫(多形螺旋线虫,Hpb)感染能缓解宿主小鼠的过敏性哮喘,推测该免疫反应的变化是由于多形螺旋线虫(Hpb)感染引起肠道内菌群变化导致。作者因此取感染Hpb和未感染的小鼠的粪便样本,对16S rDNAV4高变区进行测序。

结果显示未感染的新生小鼠肠道菌群中,典型菌类有拟杆菌(Bacteroidales)和乳酸杆菌(Lactobacillales),而感染Hpb小鼠肠道中出现了梭菌(Clostridiales)(图A)。梭菌可产生短链脂肪酸(short chain fatty acidSCFA),作者在感染Hpb的小鼠盲肠样本中检测到SCFA含量升高。

16S rDNA 测序分析中,首先对相似性序列进行聚类,分成数量较少的分类单元,再基于分类单元进行物种注释。通过对不同样本 OTU(操作分类单元,Operational Taxonomic Unit)进行PCoA分析(主坐标轴分析,Principal Coordinates Analysis),可获得样本间的差异和距离信息。测序结果显示:Hpb感染对盲肠菌群结构组成产生影响,但对肠道内菌群数量和菌类多样性影响甚微,PCoA分析可以区分感染和未感染小鼠(图BC)。

参考文献

Zaiss M M, Rapin A, Lebon L, et al. The Intestinal Microbiota Contributes to the Ability of Helminths to Modulate Allergic Inflammation[J]. Immunity, 2015, 43(5):998.