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10X Genomics 单细胞测序
产品简介

10x Genomics的Chromium Controller是基于微流控技术的单细胞文库制备系统,可以同时获 得3000-80000以上的单细胞,制备文库和Illumina平台兼容,通过测序实现对高通量单细胞数据 进行细胞群体的分类以及细胞群体间基因表达的差异分析。10x Genomics单细胞表达分析可应用 的细胞类型众多,如肿瘤细胞、免疫细胞、干细胞、神经细胞、生殖细胞、胚胎细胞等。是研究肿瘤异质性,免疫细胞群体和胚胎发育的优秀方法。

实验流程

一、文库制备

 

首先获得单细胞悬浮液,并对单细胞悬液进行活性检测,细胞活性>90%方可进行后续实验。 为保证后续细胞的捕获效率,要求细胞浓度控制在700-1200cell/ul范围内。文库制备过程中,包含 着连接有cell barcode和UMI(unique molecular identifier)的poly-T引物序列的Gel Bead和细胞被“油 滴”包裹,形成GEM(Gel Bead in Emulsion),细胞在这个反应体系中溶解,并完成反转录,形 成全长cDNA序列。接着破碎油滴并纯化后,cDNA文库进行PCR扩增,并连接测序引物。文库制备过程如下图所示:

 二、上机测试

文库构建完成后,先使用Qubit3.0进行初步定量,稀释文库至1ng/ul,随后使用Agilent 2100 对文库的insert size进行检测,insert size符合预期后,使用StepOnePlus Real-Time PCR System 荧光定量PCR仪进行Q-PCR,对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度>10nM),以保证文库质量。

质量合格的文库用Illumina平台进行测序。测序策略为PE150。

 

信息分析流程

Illumina平台测序所得原始下机序列(Raw Reads),通过去低质量序列、去接头污染等过程 完成数据处理得到高质量的序列(Clean Reads),后续所有分析都是基于Clean Reads。

康测优达10x Genomics单细胞转录组测序信息分析流程主要分为三部分:测序数据质控、 CellRanger进行基因表达定量与细胞鉴定和基于鉴定的细胞进行下游的细胞分群与差异表达基因 分析。其中,测序数据质控包括过滤测序所得序列、评估测序数据质量以及计算序列长度分布等;CellRanger基因表达定量与细胞鉴定主要利用cell barcode和UMI信息对单细胞中基因表达量进 行分析,同时CellRanger也提供根据表达量对单细胞群体进行划分,寻找群体间差异表达基因的 分析。第三步分析是基于CellRanger的细胞鉴定和基因表达定量结果,对进行下游分析的细胞和 基因进一步筛选,用高质量的表达数据再次进行细胞分群和差异表达基因分析。信息分析技术路线如下:

 

 

 

 

由于10xGenomics官方软件CellRanger分析在进行PCA、t-SNE及细胞聚类分析时未对低质量的数据进行过滤(如表达的基因总数低的细胞,在极少数细胞中检测到表达的基因)。因此虚线 所示的分析内容,会使用第三方分析工具Seurat过滤掉表达量矩阵中低质量的数据结果后进行二 次分析。对Seurat分析得到的差异表达基因进行GO、KEGG和蛋白互作网络功能分析。

案例解读

一、疾病与细胞亚型相联系 (对囊肿纤维化疾病生物学的新认识)

样品: 气管组织的气道上皮细胞

单细胞文库: ~1,500 细胞文库

测序: NextSeq  500

Analysis: Cell Ranger, Seurat

 

 

文章亮点:

(1)人肺癌肿瘤TME综合转录组;

(2)鉴定到52种基底细胞亚类,包含了新的亚群;

(3)阐明正常组织和肿瘤组织驱动的T细胞类型不同; 鉴

(4)定了免疫治疗的新靶点;

 

 

二、肺癌组织– Biopsies/TME

 

样品:

(1)5位病人的肺癌组织和相匹配的肿瘤组织

(2)From operating room to single cell suspension ~45min

单细胞文库:~4,000 细胞/文库, 总共19个文库

测序:HiSeq 4000

分析:Cell Ranger, Seurat

 

 

文章亮点:

七种已知的肺癌细胞类型 & 八种未知的聚类→ 离子细胞( Ionocytes )

鉴定极端罕见的细胞类型 (0.5%) 亚细胞群特异的新转录因子

将疾病类型与细胞亚型相关联,而不是与基因相关联;

Ionocytes 大于 > 50% of CFTR(囊性纤维化跨膜传导调节蛋白)