案例解析:TCR测序揭示肝癌中肿瘤浸润T细胞全景

当机体受到外源性入侵时,免疫系统会召集所有免疫细胞亚群通过产生免疫反应与病原体进行对抗。由于病原体存在着多种多样的差异,因而相应产生的免疫反应和和每个阶段内涉及的细胞类型也有所不同。T细胞受体中V(D)J基因区域的随机重排,导致了T细胞种类的复杂多样化;这种多样化使T细胞在识别和杀伤特异外源性抗原时则更为快速、准确和有效。

什么是T细胞受体?

T细胞受体(TCR)是由两条不同肽链构成的异二聚体,由α、β两条肽链组成,每条肽链又可分为可变区(V区),恒定区(C区),跨膜区和胞质区等几部分。目前对TCR的主要鉴别方法之一是对其α和β链进行测序。但是,若要进一步全面理解T细胞反应机理,还需对不同T细胞亚群内部和相互间的表型差异进行更精确的识别。传统免疫学研究中基于群体细胞测序获得的数据很难实现对细胞异质性和不同细胞亚群的特性分析,因此在单细胞水平进行免疫细胞表型分析越来越广泛地被应用于免疫学研究中。

TCR测序能做什么?

TCR序列具备类似于二维码结构的“溯源”能力,与TCR和细胞亚群的变异,以及揭示机体的健康和疾病状态有着密切关系。利用这些信息有可能识别和靶向定位与致病性相关的T细胞亚群,为复合抗体、疫苗研发,肿瘤免疫治疗,以及自身免疫系统疾病等研究提供了大量的有效数据信息。

这篇文章的作者收集了6位不同阶段的肝癌患者的外周血及组织样本,分离了5000多个T细胞,使用TraCeR分析方法提取每个单细胞的TCR序列信息,同时结合每个细胞的基因表达情况;实现了对细胞异质性和不同细胞亚群的特性分析,鉴定了11个T细胞亚型,并发现各亚型之间的发育历程及关系,还鉴定了T细胞耗竭marker——LAYN。

1. 转录组测序鉴定T细胞亚型

作者使用转录组测序鉴定了11个T细胞亚型,其中5种CD8+细胞亚型,6种CD4+细胞亚型。 5种CD8+细胞亚型:

A. C1_CD8-LEF1:主要存在外周血,表达LEF1、CCR7等初始marker;

B. C2_CD8-CX3CR1:高表达CX3CR1,FCGR3A等基因,与T细胞效应相关;

C. C3_CD8-SLC4A10:特异表达SLC4A10, ZBTB16等,主要是粘膜相关恒定T细胞(MAIT);

D. C4_CD8-LAYN:主要由肿瘤组织中的T细胞构成,表达CTLA1、PDCD1等T细胞耗竭marker;

E. C5_CD8-GZMK:剩余的CD8+细胞,表达PDCD1、DUSP4等marker。

6种CD4+细胞亚型:

A. C6_CD4-CCR7:主要来源外周血,表达SELL, TCF7等初始marker;

B. C7_CD4-FOXP3:高表达FOXP3的调节T细胞,大部分来源外周血;

C. C8_CD4-CTLA4:高表达CTLA4、TNFRSF9的调节T细胞,大部分来源于肿瘤组织;

D. C9_CD4-GZMA:主要是辅助T细胞,表达GZMA、CCL5等marker;

E. C10_CD4-CXCL13:特异表达CXCL13,PDCD1, CTLA4, TIGIT等耗竭marker;

F. C11_CD4-GNLY:细胞毒性T细胞,表达NKG7,GNLY, GZMB等细胞毒性分子。

A:根据T细胞表达特征进行聚类分类;B:不同类型T细胞的来源

每个细胞亚型的特异表达谱

###### 2. 发现耗竭T细胞特异表达的marker——LAYN 由于长期暴露于持续性抗原和炎症,精疲力竭的肿瘤浸润T淋巴细胞(TIL)逐渐失去效应功能,即发生耗竭(T Cell Exhaustion),TIL功能失调,记忆T细胞特征也开始缺失,失去杀死肿瘤的能力,免疫系统遭受破坏。 作者通过单细胞转录组测序和TCR测序,发现了与CD8+ T细胞耗竭相关的基因。于是接下来作者对T细胞耗竭进一步研究,发现晚期肿瘤患者体内表现出更高的耗竭细胞水平。作者注意到一个耗竭细胞特异表达的marker——LAYN,它编码透明质酸受体Layilin,在肿瘤组织处的调节T细胞(C8_CD4-CTLA4)和肿瘤组织处的耗竭T细胞(C4_CD8-LAYN)中,LAYN特异性的高表达,并且高表达的LAYN与患者的预后不良相关。

A:在细胞亚型C8_CD4-CTLA4和C4_CD8-LAYN中,LAYN特异性的高表达;B:LAYN表达量高与患者预后不良相关

###### 3. LAYN抑制CD8+ T细胞的功能 在外周血中的CD8和调节T细胞表面发现了LAYN的表达,但其他CD14、CD4、CD8等细胞表面没有表达。如果通过CD3抗体和CD28抗体激活后,在30%以上的CD8+细胞和调节T细胞表面都检测到了LAYN的表达,也检测到LAYN的mRNA水平上调。

在激活的CD8+细胞和调节T细胞中表达LAYN的细胞数量增加 体外细胞实验也证实,CD8+T细胞被激活后,LAYN的表达量上调,此外,通过反转录病毒介导过表达LAYN的CD8+ T细胞,其分泌的 IFN-γ量降低,说明LAYN对CD8+ T细胞的功能起到抑制的作用。

与使用对照反转录病毒相比,使用反转录病毒过表达LAYN,使激活的CD8+T细胞IFN-γ分泌量降低

###### 4. TCR测序发现肿瘤组织中克隆TCR比例明显升高 通过TCR-seq获得α链和β链全长序列信息,发现大部分细胞的TCR 中α链和β链都是唯一的。拥有一对完全一样的α链和β链可能来源于同一祖细胞,α-β链配对模式为3个以上细胞共有的情况,作者将其定义为扩增克隆。

肿瘤组织中,有两个甚至多个克隆TCR的T细胞比例升高 在正常组织和外周血中发现的克隆TCR只占总CD 8+ T细胞的10%左右,而在肿瘤组织中,该比例高达约30%。与外周血或癌旁组织相比,在肿瘤组织CD8 +T细胞的TCR克隆要高得多,在调节T细胞中也发现了类似的富集现象,这可能是由于肿瘤病灶处的T细胞被激活并增殖导致的。 肿瘤微环境内的T细胞易于发生耗竭或调节T细胞发生抑制,在HCC肿瘤微环境中的肿瘤浸润细胞,效应CD8+T细胞更少,而耗竭细胞更多。且越是晚期的患者,T细胞的耗竭趋势越明显。克隆的T细胞群(含有4个以上的克隆细胞)也更多的表现出耗竭趋势。 ###### 5. 拟时间状态转换分析T细胞发育过程 作者根据每个细胞亚型,结合细胞表达谱的相似性,模拟出细胞发育的过程。结果发现,CD8+ T细胞沿着以下途径进行发育:初期幼稚细胞(C1_CD8-LEF1)→效应记忆细胞(C2_CD8-CX3CR1)→C5_CD8-GZMK→耗竭T细胞(C4_CD8-LAYN)。CD4+T细胞也有类似的发育过程。

拟时间状态转换分析细胞发育过程

通过拟时间状态转换分析发现,T细胞由初期、激活状态逐渐向耗竭状态进行转换。 参考文献: Zheng C, Zheng L, Yoo J K, et al. Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing.[J]. Cell, 2017, 169(7):1342-1356.