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所熟知的ELISA知识小汇总 
2019-06-03

    所熟知的ELISA知识小汇总 
1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附测定( ELISA)用于IgG定量测定的文章,使得该技术发展成液体标本中微量物质的常用测定方法。本文将带你一一熟知ELISA技术的核心质控标准。
ELISA的基础是抗原抗体反应,在检测时,样本中的抗原或者抗体与固相载体表面的抗原或者抗体反应形成复合物,再用酶标的抗原或者抗体进行显色系统反应,当底物被催化显色后可直接相关联待检测标本中的物质含量。按照原理及操作一般可将ELISA分为四类:直接ELISA,间接ELISA,双抗夹心ELISA,竞争抑制ELISA。其他ELISA都是隶属于这四类或者组合衍生。下面我们将对每一类进行细解。
1. 直接ELISA
直接ELISA是最简单的一种,其方法是抗原按照一定浓度包被在固相载体上,洗涤孵育后,只需加入一种特异性的酶标抗体,再经过底物显色反应即可判读结果。此方法可常用于单抗亚型和血清种属等检测。但由于直接法只经过了一步信号放大,其灵敏度有限,所以它的应用范围也是有限的。

2. 间接ELISA
间接ELISA的过程中加入了一种非酶标抗体,与固相载体的抗原结合,再用酶标二抗特异性结合,最后加入底物显色。此方法由于信号经过了两步方法,提高了检测灵敏度。另外所有相同种属的一抗均可以同用一种酶标二抗,这样科研工作者就无需进行一抗标记了,大大的缩减了工作量,是目前常用的方法手段。

3. 双抗夹心ELISA
可分为双抗原夹心法和双抗体夹心法,其原理都是一样的。比如双抗体夹心法,捕获抗体包被在固相载体上,加入抗原结合,再次加入的检测抗体结合在抗原上,一起形成“sandwich”夹心。此方法的检测对象必须是多价抗原,包含两个或者两个以上的表位,一般为大分子蛋白。对于各种天然的免疫蛋白类分子大多都是采用这种检测方法。

4. 竞争抑制ELISA
其主要原理是用待检抗原或抗体去干扰已经预先设计好的体系,最终显色的结果与待检抗原或抗体的干扰程度成负相关。这种方法多是应用于小分子抗原或者半抗原,只要有一个结合部位即可。
  在ELISA的研发制备中尤为重要的就是它的指控流程,包括抗原设计及制备筛选,抗体制备,标准品的定量,检测液的优化,试剂盒的组装,以及各种性能的验证。对于科研工作者来说,要制备一个好的ELISA kit,需要具备敏感性高,特异性强,重复性好,并且其试剂稳定、易保存,操作简便等。下面来看一下ELISA的质控控制。

1. 抗原抗体选择:ELISA检测原理基于抗原抗体反应,其质量影响了试剂盒的性能。对于大分子蛋白抗原,多采用双抗体夹心法,使用最优的抗体对,且至少有一种为单抗,配对筛选最佳信噪比的包被和检测抗体。对于抗原为多肽和小分子(或者偶联物),多采用竞争抑制法,抗体的是经过验证的单克隆抗体或者多克隆抗体。
2. 标准品:对于标准品定量的准确性,每个公司对于定量标准和方法可能会有不同,这是企业标准。试剂盒使用的标准品多为重组蛋白或者单价的小分子, 定量可参考国际标准品,国家标准物质信息网或者一些大公司,如R&D, Abcam等。标准品的定量直接会决定试剂盒最后样本的检测结果。
3. 天然样本验证分析;我们在选择样本时,避免使用有外源性污染的样本,避免血样本出现溶血、细菌污染,最好使用较新鲜样本,避免反复冻融。血清是最为常见的检测样本,但是大约40%的血清标本中含有非特异性干扰物质,可以不同程度影响检测结果;常见的干扰物质有:类风湿因子RF、补体、交叉反应物质和异嗜性抗体等其他物质等。避免其发生的方法有:①标本用联有热变性IgG的固相吸附剂处理。②用2-巯基乙醇加入到标本稀释液中使RF降解。③56℃ 30 min加热血清使补体灭活。
在样本检测中,稀释对于实验的成功也至关重要,稀释过度以及稀释不足均有可能导 致样本的测值低。Elisa 实验较为常见的一个现象就是钩状效应,即抗原与抗体 比例不合适而导致假阴性的现象,抗原过量称为后带效应。当样本中目标物含 量很高,而没有进行正确的稀释,就有可能会导致假阴性反应。
4. 阳性及阴性对照:用于评判试剂盒以及当次检测结果的客观性和可信性。阴性对照一般选择blank或者一定不含有受检物质的样本;而阳性对照是经检验呈现阳性结果的样本,其含量可用于评判当次ELISA检测结果的准确性和客观性。
5. 特异性,包括交叉反应和干扰效应,在研发过程中需消除样本非特异性引起的假阴性和假阳性。在ELISA试剂盒中最为关键抗体一定是经过反复检测的,保证不与相关的类似物反应。
6. 灵敏度,此标准可评估试剂盒质量优良的一个关键因素,这是由使用的抗体效价等决定的,在研发过程中,一般会优化保证高灵敏度、低背景的检测结果从而大大提供试剂盒的灵敏度。
7. 精密度,即为同一样本重复测定的符合程度,可分为批内精密度和批间精密度。一般是选取同一批次或者不同批次的试剂盒对不同浓度的样本进行定量检测,需要尽量降低批次差异带来的系统误差,保证相同样本结果的重复性。一般在研发过程中使用多个样本检测不同批次进行对比,保证试剂盒通过稳定性和重复性的检测。一般厂家的kit需要保证批内批间CV%<20%。
8. 线性;样本经梯度稀释后检测分析即为线性分析,此过程也是用于消除样本的基质效应。基质效应导致的结果有假阴性和假阳性两种,在线性稀释时就可以辨别出来,当存在基质效应时样本的稀释线性就不会满足,说明该类样本有可能不适用ELISA kit,在研发阶段就需要优化反应体系等消除基质效应带来的干扰。
9. 回收率;回收实验可检测试剂盒是否受干扰因子的影响,也是辨别基质效应的一种方法。在研发过程中,一般会采用低、中和高浓度的分析物被掺入到已知浓度的验证样本中,进行回收实验测定,回收率应介于80%-120%,表明试剂盒的性能较好。
10. 稳定性,即试剂盒在有效期内的稳定性。通常采用加速降解的方法来推断试剂盒的有效期。通常试剂盒在37℃放置一天折合有效期2个月,实际工作中,一般将试剂盒在37℃破坏3-7天后,然后检测上述指标,观察是否在范围内。也可留样至有效期后进行检验,来衡量有效期,对于批量大的指标,可将加速降解和留样检验相结合的方法。

 

 

 

 

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