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机制不知道怎么做?不妨看看Science….
2019-09-26

今天分享一篇关于胆固醇与造血作用相关的文章,文章发表在Science杂志上,题为“Aibp介导的胆固醇外排指导造血干细胞及祖细胞的命运。文章由一个科学现象作为引子,通过大胆的假设,并应用先进的ChIP-seqRNA-seqATAC-seq等测序技术小心求证,一步步抽丝剥茧,最终得到整个调控的网络图。

研究背景和要解决的科学问题

 

在脊椎动物中,造血干细胞和祖细胞(HSPCs)通过产生所有类型血细胞来维持造血输出。在胚胎发生过程中,HSPCs从位于背主动脉(DA)底部的少数内皮细胞(ECs)中产生,HSPCs的产生受血管调控。高胆固醇血症是动脉粥样硬化发生的主要诱因,并且能加速HSPCs的扩张和迁徙。高胆固醇血症对造血作用的分子机理至今任然不清楚。已有研究表明Aibp2缺陷胚胎胆固醇含量增加,并且Aibp2调控背主动脉血管生成。但Aibp2造血作用的分子机理至今仍然不清楚。

因此本工作的主要目的就是研究Aibp2通过何种分子机理调控造血作用。

 

科学问题拆解

 

1Aibp2在造血过程中是否有作用?

2Aibp2能够调控胆固醇的含量,那么胆固醇是否对造血过程有影响?

3)如果胆固醇对造血过程有影响,那么胆固醇又是通过何种途径影响造血过程?

4)最终Aibp2影响造血过程的分子机理又是怎样的?

 

实验设计及结果解读

 

为了研究Aibp2在造血过程中的功能。作者首先生构建了apoa1bp2−/−敲除斑马鱼,发现其形态正常。在apoa1bp2−/−中,腹侧背主动脉中表达的HSC标记基因runx1cmyb和胸腺中HSC衍生的T淋巴细胞标记基因rag1表达均显著降低。流式细胞仪分析发现,Aibp2敲除减少了cmyb+kdrl+细胞(受精后28 - 60小时腹侧背主动脉中新生的HSCs)的数量。这些数据表明,Aibp2直接调控HSC的发生和特化

由于Aibp2缺陷胚胎胆固醇含量增加,那么胆固醇对HSC产生是否有影响?作者使用降胆固醇药物阿托伐他汀处理apoa1bp2敲除或敲降突变体。在Aibp2缺失的斑马鱼中,阿托伐他汀处理能够减少游离胆固醇水平,提升HSC标志基因runx1表达。背主动脉阿托伐他汀扩大了cmyb + kdrl +细胞层。结果表明有效的胆固醇代谢能够调控HSC出现。

胆固醇合成需要主控转录因子Srebp2,那么Aibp2是否对Srebp2有调控作用?Srebp2由结合在内质网上的前体蛋白产生;当细胞胆固醇消耗时,前体通过两步蛋白水解,将Srebp2 N端转录激活结构域释放到细胞核中,并指导胆固醇合成基因HmgcrSrebf2和胆固醇摄取基因Ldlr 的表达。通过在Aibp2突变体中检测Srebf2的表达情况,发现Aibp2缺失导致Srebf2表达下调,Aibp2过表达会引起srebf2表达上调在人中AIBP能够增加高密度脂蛋白(HDL,胞外转运胆固醇)接受胆固醇的能力,导致胆固醇外排。作者发现AIBPHDL以剂量效应的形式激活Srebp2这些结果表明Aibp2介导胆固醇被HDL接受,导致细胞内胆固醇水平下降从而激活Srebf2

既然Aibp2能造成胆固醇外排调控Srebp2的活性并且调控HSC的发生,那么是Srebp2介导了Aibp2对造血的作用吗?

作者生成了srebf2/敲除突变斑马鱼。发现Srebp2突变显著降低了runx1cmybrag1HSC标志基因的表达。同样,敲降Srebp2扰乱了HSC出现和造血作用的缺失,显著降低cmyb + kdrl + HSCs细胞数量。而过表达Srebf2能够补救缺失表型表明Srebp2对造血作用具有促进作用。

同时,在Aibp2 敲除突变体中注射核Srebf2 mRNA或者Aibp2缺失突变体中过表达Srebf2能够补救Aibp2突变造成的受损HSC出现。说明Srebf2作用于Aibp2的下游。

综上表明Srebp2作用于Aibp2下游并指导HSC的特化。

由于Notch信号HSC特化中的关键作用,那么Srebp2是否调控Notch信号? Aibp2Srebp2缺失显著降低了notch1b背主动脉中的表达,暗示apoa1bp2srebf2突变体HSC出现的受损是由于Notch信号减弱造成的。为了证实这一猜想,作者在apoa1bp2-srebf2缺失突变体中过表达notch1b能够恢复apoa1bp2-srebf2缺陷动物中runx1 mRNA的表达。通过分析notch1b启动子发现,其存在Srebp2潜在的motif;通过ChIP-qPCR验证Srebp2确实结合在notch1b的启动子区域。因此Srebp2notch1b表达。

作者进一步使用RNA-seqChIP-seqATAC-seq数据系统验证Srebp2调控Notch信号。作者比较了小鼠造血内皮细胞(HEC)、内皮细胞EC(包含HECpre-HSCs)和有淋巴潜能的祖细胞(pHPLPs)RNA-seq数据,发现HECs相对于ECs或者pHPLPs上调基因中Notch通路基因显著被富集;并且Srebp2 ChIP-seq数据发现 peak在这些上调基因的启动子中显著富集。同时ATAC-seq数据表明, HECsSrebp2 ChIP-seq peak确实位于活跃的转录相关开放染色质区域, 79% ChIP-seq peakATAC-seq peak重叠 综上Srebp2Notch通路的关键调控因子。

 

总结

 

1)作者由Aibp能够影响造血作用和胆固醇,推测Aibp调控胆固醇并影响造血作用,并且得到很好的证实;

2)接着作者调查这其中的分子机理,首先考虑的就是胆固醇合成主控转录因子Srebp2,如期获得了Aibp调控Srebp2的铁证,并且Srebp2就具有调控造血作用的新功能;

3)最后作者将目标锁定到造血作用的主控信号途径Notch信号途径。并且Srebp2就能够调控Notch信号;

不知道这三步中作者有没有进行大量筛选,才得到这样“如有神助”的结果;但不管怎么样要想发Science,工作就得做的细致、漂亮和让人惊叹~