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都是做耐药性研究,换个思路,Nature Medicine如此简单
2019-10-08

癌症是全球死亡率第二的疾病,靶向治疗则给癌症患者带来了福音。但靶向药的普遍问题在于,长期使用会产生耐药性。前期有大量的工作对耐药性的机制进行了研究,鉴定了大量的耐药相关突变,但这些突变的发生率很低、只能解释一小部分患者耐药的原因。大部分患者中不存在耐药突变,却产生了耐药性。本文就是从基因表达的层面,尝试揭示结直肠癌西妥昔单抗的耐药机制。

 

研究背景和待解决的科学问题

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是我国最常见的消化道恶性肿瘤之一,具有发病率高,病死率高,治愈率低等特点。CRC细胞表面会出现大量的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR),而西妥昔单抗(cetuximab)是针对EGFR的靶向药物,它能特异性结合EGFR的胞外结构域,抑制EGFR与酪氨酸激酶的作用,阻断细胞内信号转导通路,从而抑制癌细胞增殖,诱导癌细胞凋亡。不幸的是,CRC患者经常产生西妥昔单抗耐药性,前期的工作已经鉴定出了很多耐药相关的基因突变,如KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA,以及EGFR本身的突变。但是这些突变仅能解释小部分患者耐药的原因,对于大部分患者耐药的原因,还需要更多的工作。因此,本工作的主要目的,是从基因突变之外的角度,来揭示耐药性产生的原因。作者选择了基因表达和ncRNA的角度来开展工作,本工作的主要目的,是来鉴别:

  1. 西妥昔单抗耐药性机制是否有ncRNA参与调控?如果有,是什么ncRNA
  2. 如果有ncRNA,那么它是如何影响耐药性的?
  3. 如果有ncRNA,其上下游的分子分别是什么?

 

Q1:西妥昔单抗耐药性机制是否有ncRNA参与调控?如果有,是什么ncRNA

为了回答上述问题,作者构建了敏感CRC囊性细胞(cystic colonies, CC)和耐药CCcetuximab-resistant cystic colonies, CC-CR),并做了RNA-Seq和小RNA测序(Small RNA-seq),发现CC-CRCC相比:

  1. 141种转录本上调以及220种转录本下调,上调最显著的转录本是lncRNA MIR100HG
  2. 7miRNA上调以及24miRNA下调,其中上调最显著的miRNAmiR-125bmiR-100
  3. MIR100HG位于11号染色体,是miR-100let-7a-2miR-125b-1的宿主基因
  4. qRT-PCR实验证实,无论是否存在西妥昔单抗,CC-CR中内源MIR100HGmiR-100miR-125b的初级体和成熟体均显著上调
  5. TCGACRCRNA-seq数据存的分析显示,miR-100miR-125b表达与MIR100HG表达正相关。

上述结果表明,耐药细胞中的lncRNA MIR100HG显著上调并导致miRNA miR-100miR-125b的显著上调,这2miRNA可能与耐药有关。

 

Q2:如果有ncRNA,那么它是如何影响耐药性的?

既然发现了miR-100miR-125b在耐药细胞中高表达,那么这种表达模式是否与耐药性相关呢?为了回答这个问题,作者在CC-CR中对这2miRNA的表达进行干预,并观察对细胞的影响,发现:

  1. 在耐药细胞CC-CR中阻断miR-100后,西妥昔单抗会降低colony number;而阻断miR-125b或同时阻断2miRNA,药物处理则会更显著的降低其colony number
  2. 在不耐药细胞CC中过表达miR-100miR-125bmiRNA对其CC colony number没有影响,但双miRNA过表达增加其colony number
  3. 在不耐药细胞CC中同时过表达miR-100miR-125,可以大大提高西妥昔单抗处理时细胞的生存率。
  4. 细胞增殖标记Ki-67和细胞凋亡标记Capase-3断裂体染色实验结果与上述colony number计数的结果相符。
  5. 将不同操作的CC-CRCC移植到裸鼠皮下,并用西妥昔单抗处理时,也观察到相似的结果。

上述结果表明,miR-100miR-125b过表达是否确实导致了耐药性。

 

Q3:如果有ncRNA,其上下游的分子分别是什么?

既然miR-100miR-125b与耐药性正相关,那么:

1miRNA是通过调控哪些下游基因的表达或者通路影响耐药性的?

2miRNA表达受到哪些上游因素的调控?

作者进一步挖掘了RNA-Seq数据,发现与CC相比,CC-CRWnt信号通路的2个基因DKK1DKK3的表达降低了30倍以上;miRNA靶标预测工具发现这2个基因的3'UTR分别包含了miR-100miR-125b的结合位点。进一步预测发现除了这2个基因外,ZNRF3RNF43APC23Wnt/β-catenin通路的基因也是miR-100miR-125b的潜在调控目标。因此作者构建了荧光素酶报告系统,证实了这五个候选基因在CC细胞中是受到miR-100/miR-125b直接调控的。免疫印迹法也证实,上述基因的蛋白水平也受到这2miRNA的调控。

 

那么miRNAWnt通路相关基因的调控,是否导致Wnt通路功能的变化呢?作者从多方面做了探索:

  1. CC-CR中酪氨酸磷酸化的活性p-Y489 β-catenin大大增加;
  2. CC-CRWnt通路下游靶基因的mRNA表达明显上调;
  3. CC中过表达miRNA后,Wnt通路下游靶标基因表达被激活(双miRNA过表达 > miR-125b > miR-100);
  4. 裸鼠中移植物CC-CR耐药细胞后,使用西妥昔单抗处理只能减缓肿瘤的生长,而联合使用ICG-001Wnt活性抑制剂)则能导致肿瘤消退。

上述结果表明,miR-100miR-125b是通过对Wnt通路相关基因的调控,导致耐药性的产生的。

上面的结果表明,miR-100/125b通过调控Wnt通路导致耐药性的产生,那么这2miRNA的表达又是受什么调控的,为什么在耐药细胞中表达被激活呢?为了回答这个问题,作者开始往上游研究。

 

由于lncRNA MIR100HGmiR-100miR-125b的宿主基因,通过对MIR100HG启动子区进行转录因子预测,并结合RNA-Seq数中转录因子的表达情况,作者将注意力集中到了转录因子GATA6----该基因在耐药细胞CC-CR中表达显著下调。

  1. 不耐药细胞CC进行药物处理后,MIR100HG表达降低,而GATA6逐渐升高;
  2. 不耐药细胞CC中敲低GATA6导致MIR100HG上调;
  3. 萤光素酶报告实验显示,MIR100HG启动子活性受抑制程度依赖于GATA6的过表达浓度;
  4. 通过Motif分析,在MIR100HG启动子区域确定了4GATA结合位点(G / AGATAA / T),顺序删除和突变这些结合位点的实验结果表明,GATA结合位点2TSS上游-1,198)是GATA6抑制MIR100HG转录活性的主要位点。

 

 

上述结果表明转录因子GATA6MIR100HG的负调控因素,在耐药细胞中其表达的降低导致了MIR100H表达的激活,并导致miR-100/125b表达升高,进而导致耐药性的产生。那么,又是什么因素使得GATA6在耐药细胞中表达降低呢?

作者通过miRNA靶标预测,发现GATA63’UTR区也存在1miR-125b的结合位点

  1. 荧光素酶报告实验表明,CC细胞中过表达miR-125b能抑制含有GATA6 3’UTR的荧光素酶活性,对miR-125b结合位点进行突变则解除了这种抑制;;
  2. 不耐药的CC细胞中过表达miR-125b使得GATA6水平降低;而在耐药的CC-CR细胞中敲低miR-125b则会使GATA6水平降低;
  3. TCGA数据库分析显示,在IVCRC患者中,GATA6显著下调,而MIR100HG显著上调,且低表达GATA6CRC患者往往高表达MIR100HG

综上所述,这些发现表明,GATA6MIR100HGmiR-125b之间的双向负调节回路是西妥昔单抗耐药的分子基础。

总结

这是一篇典型的研究药物影响相关分子的范例。作者从RNA-SeqSmall RNA-seq数据着手,寻找最可能与药物作用相关的关键基因;找到目标基因之后,通过多种实验手段,确认了目标基因影响了药物作用;接着再回到RNA-Seq数据,结合生信预测,寻找到目标基因的上下游基因/通路;最后临床样品验证,结果能够支持临床前研究。在此过程中,RNA-Seq数据被反复深挖,得到了很多有用的信息。整体思路非常清晰,特别值得药物研究者借鉴。

参考文献:

Lu Y., Zhao X., Liu Q. et al. lncRNA MIR100HG-derived miR-100 and miR-125b mediate cetuximab resistance via Wnt/β-catenin signaling. Nat. Med. 2017, 13, 1331-1341.