技术支持
Support
技术突破:超低起始量Nano UMI meRIP-seq
2019-12-02

RNA修饰介导的基因表达调控是目前表观研究的热点之一,其中m6A修饰又是最主流的研究方向,目前已经在动物、植物甚至真菌中被发现广泛存在。但不同物种的m6A修饰具有各自的特征,如植物中m6A peak的分布、motif不但和动物的有显著区别,而且还具有很强的物种特异性。同时,m6A对基因表达调控的方式、在不同生物学过程中的调控作用我们目前还知之甚少,整个领域尚处于起步阶段。因此在不同物种、不同生物学过程中,对m6A的修饰状态进行全基因组范围的研究,并建立其和基因表达的调控关系,是目前最基础也是最重要的工作之一。

m6A修饰目前最主要的研究手段就是meRIP-seq。这是Dominissini等人在2012年发展出来的方法。该方法首先使用oligo dT捕获mRNA,将RNA打断成100 nt左右的小片段之后,使用识别m6A的抗体对含有m6A修饰的RNA片段进行富集,进而对得到的RNA片段进行RNA-seq文库的构建。

受制于免疫共沉淀体系、建库灵敏度的限制,该方法建立时使用了2.5 mgRNA作为起始。如此高的RNA用量将大大限制该技术的应用范围,因此2013年,Dominissini再次在Nature Protocol上发文,发布了更新后的meRIP protocol,将RNA的起始量降低到了300μg

 

meRIP-seq技术的革新

优化:

此后发表的meRIP-seq文章,RNA建库起始量至少为200μg total RNA。这对于相当部分来源的样品来说,仍然是一个很难达到的量。因此2018年武汉康测基于其高灵敏度的UMI-enhanced建库技术,在未改变建库原理的情况下,将meRIP的建库RNA起始量降低到了20 ug,目前已为数十个客户提供了高质量的技术服务。

 

突破:

但是对于一些珍稀的样品,20 ug也是一个难以获得的量。但建库流程的优化已经很难大幅度降低RNA的起始量了。曙光出现在2018年,该年9月的PLoS Biology杂志上发表了一种超低起始量的meRIP-seq实验方法,将RNA的最低起始量降低到了500ng该方法的主要改进为直接针对total RNA进行m6A抗体富集,利用残留的rRNA增加建库RNA起始量,并使用SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2试剂盒进行建库,之后剔除rRNA,二次扩增获得最终的文库。

 

这种建库方式,不但解决了微量RNA无法建库成功的问题,同时由于采取了rRNA剔除的方法,不但能够获取之前的meRIP-seq获得的polyA-RNA的m6A修饰情况,同时还可以获得非pol II转录的lncRNAcircRNA甚至是病毒RNAm6A修饰情况。

 

终极革命:Nano UMI meRIP-seq

超低起始量的meRIP-seq,意味着要使用更多的PCR扩增循环数,因此扩增的偏好性会在某些位点处形成大量的重复reads。这些重复reads一方面会形成假阳性的peak,另一方面又会掩盖真实peak的信号。

康测科技的UMI-enhanced deep sequencing technology正是为消除假阳性重复开发的建库技术,目前已广泛应用于RNA-seqmiRNA-seq16s rDNA-seqT/BCR-seq等领域。KC-digital RNA-seq试剂盒能够彻底消除PCR引入的扩增偏好性,因此特别适合于低起始量的RNA建库。

2019年,武汉康测参考PLoS Biology描述的低起始量meRIP-seq建库原理,融合KC-digital RNA-seq建库技术,开发出Nano UMI meRIP-seq

 

 

Nano UMI meRIP-seq的优势:

  1. 起始量低:建库起始量低至500 ng Total RNA!!
  2. RNA要求低:部分降解的RNA也可以进行meRIP-seq了!!
  3. UMI彻底去除假阳性peak,挽回假阴性peak!!
  4. 全面的修饰信息:除mRNA外,lncRNAcircRNA乃至病毒RNA的修饰情况一网打尽!!

 

康测从来不做虚假宣传、向来以实验证据说话。那就一起来看一下Nano UMI meRIP-seq1ug RNA起始量的实际建库和分析结果吧:

1)建库效果

RNA来源

RNA用量

PCR条件

人源

1 ug

5+15 cycles

可见文库大小在300bp左右,说明插入片段在150bp左右;文库产量很高;

 

2)PeakRNA上的分布

peak在基因RNA上的分布发现,stop codons位点存在最高峰,在3’UTR显著富集【这是meRIP-seq数据分析最重要的结果之一,不show这个图的都是耍流氓】。

 

3)Motif

motif分析发现存在标准的m6A RRACH motif

 

4Example of m6A modified genes

我们随机挑选两个peak相关基因绘制reads分布可视化图,IP在这些基因上存在明显的富集

 

以上结果都表明:1 ug起始的KC-nano UMI meRIP-seq结果和高RNA起始量的结果一样可靠和优秀!!!

 

小伙伴们,你是不是对meRIP-seq心向往之、朝思暮想但又苦于样本量稀少,无法展开研究?尝试一下康测最新的KC-nano UMI meRIP-seq测序吧!!有兴趣的小伙伴请联系当地销售经理或直接留言。