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Cell Metabolism: lncRNA调控胰岛细胞的发育和功能
2019-12-10

背景

1型(type 1 diabetesT1D)和2型糖尿病(type 1 diabetesT2D)是由于胰腺胰岛无法维持血糖控制而发生的慢性病。组成胰岛的细胞包括胰岛β细胞、α细胞、δ细胞和PP细胞等,其中,β细胞分泌胰岛素,促进葡萄糖吸收并抑制肝葡萄糖合成;α细胞分泌胰高血糖素,促进葡萄糖合成和肝葡萄糖释放。而PAX6是调控胰岛细胞发育和功能的重要转录调节因子之一。

 

待解决的科学问题

长链非编码RNAlncRNA)是一类具有高度时空特异性调控RNA。在人和小鼠的β细胞和α细胞中已鉴定出数千种lncRNA。今天我们跟大家分享一篇发表在Cell Metabolism上的文章“The Long Noncoding RNA Paupar Modulates PAX6 Regulatory Activities to Promote Alpha Cell Development and Function”作者的研究目的是鉴定调控胰岛细胞发育和功能的lncRNA

 

实验设计

1.生物学模型:胚胎小鼠成年小鼠,包括T2D模型db/db小鼠;永生化胰岛细胞系,包括α TC-1细胞和β TC-6细胞。

2.实验手段:

aTotal RNA-seq

bqRT-PCR

c)单分子荧光原位杂交smFISH

dCapture hybridization analysis of RNA targets followed by mass spectrometry (CHART-MS)

eChIP-seq

f免疫荧光染色

 

结果和主要发现

1、有没有调控胰岛细胞发育的lncRNA?如果有,是什么lncRNA

1)通过筛选胚胎成年小鼠胰腺RNA-seq数据,得到572种差异表达lncRNA。其中,胚胎小鼠富集了108lncRNA,成年小鼠富集了171lncRNA

2)作者又通过lncRNA与临近蛋白编码基因的相对位置远近,筛选出可能具有调控功能的一批lncRNA。这批lncRNAGO富集到胰腺发育相关功能。

3)Pax6基因上游的lncRNA Paupar引起了作者的注意,在T2D模型db/db小鼠中,Paupar的表达量降低了两倍,这表明Paupar可能在胰岛功能障碍中起作用。

4)qRT-PCR结果表明,成年小鼠中Paupar在胰岛中大量富集,且Paupar在小鼠出生后7天(P7)和P14之间启动表达

5)Pauparα细胞中高度富集,而Pax6αβ两种细胞群中表达相同

6)单分子荧光原位杂交技术表明,Paupar主要定位于核内

 

2lncRNA Paupar通过什么机理调控胰岛细胞发育?

1) 在α TC中敲低PauparPaupar knockdownPaupar KD),Pax6表达未受影响,但PAX6目标基因,如GcgMafBArxNeuroD1均下调,GcgMafB下调程度与Paupar KD程度正相关;非PAX6目标基因,如Foxa2表达量不受Paupar KD影响。

2)作者设计了能捕获Paupar的探针,通过质谱分析捕获得到的蛋白(CHART-MS),发现56种蛋白被富集,GO分析结果表明蛋白与RNA剪接相关

3)由于Pax6有两种异构体,作者猜测Paupar可能与Pax6的可变剪接有关。qRT-PCR结果表明,敲除Paupar后,Pax6异构体之一Pax6 5aRNA表达量下降,但Pax6总体表达量不变。

4)蛋白PAX6ChIP-seq结果显示,结合基因的26244个位点中,10%的位点(2046peak)在Paupar KD后的结合能力发生变化,这些peak相关基因GO富集到α细胞功能相关的生物学过程,包括葡萄糖稳态、离子转运调节以及细胞对葡萄糖应激。

 

3lncRNA Paupar在动物模型中是否影响了α细胞发育?

1)作者构建了小鼠模型,将组蛋白融合绿色荧光蛋白替代Paupar基因,并用体内胰岛素耐受性测试来评估Paupar敲除(Paupar knockoutPaupar KO)小鼠对急性低血糖反应的能力。与WT小鼠相比,6周大的KO小鼠中血糖明显降低,表明KO小鼠恢复血糖水平的效率较低

2)在胰岛素耐受性测试之前和期间测量KO小鼠血浆胰高血糖素,发现胰岛素注射后30分钟,KO小鼠的血浆胰高血糖素相对于WT小鼠降低了约2.5倍,这表明KO小鼠在低血糖环境中分泌的胰高血糖素明显减少

3)在低浓度葡萄糖(2 mM)和10 mM精氨酸(两者均为胰岛素分泌促进剂)的条件下,从6周龄KO小鼠得到的体外培养胰岛分泌的胰高血糖素比从野生型小鼠得到的胰岛分泌的分别低~60%47%KO小鼠胰岛比对照胰岛分泌的胰高血糖素整体低~71%

4)对6周龄Paupar WTKO小鼠胰腺进行形态学分析显示,WT胰岛的13%为α细胞,但仅6%的 KO胰岛为α细胞,减少了~2.25倍。与WT71%)相比,KO79%)的β细胞面积相对于胰岛面积稍有增加。WTKO小鼠之间的平均胰岛大小没有显著差异

5)转录组测序数据表明,KO小鼠胰岛差异表达的3106个基因中有75个基因是已有报道的α细胞富集基因(689个)。与体外研究一致,KO小鼠的细胞显示Pax6 5a以及一些PAX6 α细胞靶基因显著下调,而Pax6 mRNA水平总体不变。KO小鼠胰岛差异表达的3106个基因中有328个基因与Paupar KD α细胞差异表达的2056个基因是重合的。

 

至此,作者已经充分证明了lncRNA Paupar通过作用于Pax6的剪接,影响其下游基因表达,从而调控胰岛α细胞的发育和功能

 

 

本文总结

本文是篇研究lncRNA调控作用的典型论文,思路清晰明确,值得借鉴。首先通过RNA-seq数据,筛选出可能有功能的lncRNA,再以基因敲除等分子手段鉴定其调控的重点基因,最后在动物模型中验证。值得一提的是,lncRNA对基因的调控并不一定是影响其总体表达,当发现操作了lncRNA之后靶基因表达量不变,还可以从可变剪接的角度考虑。当然,文章仍留有空间,例如,并没有在lncRNA影响mRNA剪接的具体机理方面下更多功夫,还有待后来研究者的努力了。