技术支持
Support
从一篇JCI说起:术业有专攻----临床科研应该怎么做?
2020-06-15

我们始终认为,在基础科研领域,让临床医生和生物学家进行PK是不公平的。毕竟临床医生既缺乏时间、精力和齐全的仪器设备,也没有多年的实验技术积累。但是临床医生也有自己天然的优势,那就是临床病理样本资源。充分利用这些资源进行临床科研,不但可以不落下风,研究成果往往具有更大的应用前景。今天我们跟大家分享一篇发表在The Journal of Clinical Investigation上的文章,学习一下如何选择和利用临床样本做出高水平且有临床意义的工作。

 

研究背景和待解决的科学问题

慢性胰腺炎(chronic pancreatitis,CP)是一种不可逆的胰腺实质纤维化疾病,发生时伴有严重的腹痛,影响生活质量。酒精和吸烟被确定为成人CP的主要病因,同时遗传和其他特发性因素约占病例总数的20%,因此作者选择对CP的免疫特征进行研究。CP是目前较为常见的疾病,并且治疗费用昂贵,对病患个人、家庭和社会的影响很大,但目前尚无有效的疗法及早期诊断标志物 。目前通过细胞实验和动物模型的研究结果认为,无论CP的病因如何,CP病人的免疫反应是一致或者相似的,但这一点并没有可靠证据支持。造成这一现状的原因,主要是临床组织的缺乏,前期的研究多是通过外周血单核细胞的分析得出的结论。

因此,本研究试图通过对组织样本免疫微环境的分析来回答上述问题。作者收集了以下几种不同类型的胰腺组织:
1) 27例遗传性CP患者的胰腺组织;
2) 13例无糖尿病史的特发性CP患者胰腺组织;
3) 9名器官捐赠者的健康胰腺组织。
 

作者对上述样品进行了流式Luminex分析TCRβ测序,分别从组织的免疫细胞组成、T细胞组成和T细胞受体(TCR)几个不同的维度,对不同类型组织样品的免疫特征进行研究。

 

01 免疫细胞的组成

1)免疫组化实验表明,与对照组胰腺组织相比,CP中CD45+细胞明显增多。CD45+是白细胞标志物,这表明炎症组织浸润了大量的免疫细胞;

2)那么是哪些免疫细胞亚型增加了呢?流式细胞分析表明,CP的这些CD45+细胞中,CD3+ T细胞比例上升,CD68+巨噬细胞比例下降。

3)那么核心问题来了,特发性CP和遗传性CP是否和之前的研究结果一样?免疫反应是一致的吗?对CD68+巨噬细胞的含量进行分析发现:特发性CP和遗传性CP中,CD68+和CD68+CD11c+细胞在两种类型的CP样品中的占比均显著降低,在两种类型的CP样品中CD68+ CD11c-细胞的占比变高,并且特发性CP的上升程度更为显著。

 

上述结果表明,CP与健康胰腺相比,富集了更多的后天免疫T细胞;且特发性CP和遗传性CP的免疫细胞组成是有显著差异的,特发性CP组织中富集了更多的先天免疫巨噬细胞

 

02 T细胞组成

了解了免疫细胞整体组成和先天免疫巨噬细胞的亚型差异,作者继续分析后天免疫CD3+T细胞的亚型差异。
1)与健康组织相比,CP组织中的CD4+ T细胞比例显著上升,CD8+ T细胞比例显著下降
2)两种CP组织比较,遗传性样本中CD3+ T细胞比例高于原发性样本
3)值得注意的是,CD4+细胞亚型,如T-bet+ (Th1),GATA3+ (Th2),RORγt+ (Th17/22)和CD25+FOXP3+ (Treg),在遗传性CP样本中的克隆均得到大幅扩增,这表明功能活跃的CD4+辅助性T细胞亚群可能在遗传性CP的发病机理中起关键作用

上述结果表明,遗传性CP富集后天免疫CD3+ T细胞。在这些T细胞中,各类辅助性CD4+ T细胞克隆数大增,表明它们可能对遗传性CP发病机理有重大影响

 

综合上述结果我们可以发现,遗传性CP与特发性CP相比,具有更高的CD3+ T细胞比例,特发性CP比遗传性CP中CD68 +巨噬细胞增多,当我们将T细胞/巨噬细胞比例进行量化之后,这个特征就更加显著。这表明不同病因CP人群的免疫机制是不同的

前期研究发现:TCR克隆性和多样性已被发现影响多种疾病进程,例如恶性肿瘤和自身免疫性疾病等。考虑到CP胰腺之间免疫谱的差异,作者预测胰腺浸润的T细胞中TCR谱可能发生变化,因此通过TCR-seq对两种CP组织中的TCR组成进行了研究。TCR测序一般从以下几个维度来进行分析:
1)T细胞受体的多样性和克隆性;
2)T细胞受体V-J使用规律;
3)共性或特征性TCR的发现;

 

 

 

03  T细胞受体(TCR)结构

1)TCR的多样性和克隆性
作者首先对不同类型CP胰腺组织以及对照胰腺组织中浸润的T细胞的数量多样性克隆性进行了分析,发现和对照胰腺组织相比:CP胰腺组织中T细胞数量显著增加(图C)、TCR多样性显著升高(图D),TCR的克隆性则显著降低(图E)。不同类型CP组织之间虽有差异,但并不显著

 

2)TCR的V-J使用规律

接下来作者对正常胰腺组织、遗传性CP和特发性CP胰腺组织中T细胞受体的V-J使用规律进行了分析,发现:

  • (1)各组之间V-J基因家族使用的模式相当,所有组中最主要的Vβ基因家族都是TRBV7,TRBV6和TRBV5;

  • (2)对V-J使用组合规律进行分析,发现正常胰腺组织和CP组织的TCR存在9种显著差异的Vβ-Jβ基因组合,可以实现对正常胰腺组织和CP胰腺组织的有效区分;

  • (3)在不同CP类型的组织中,V-J使用是否有区别呢?对与Jβ2配对的Vβ使用频率进行分析发现,TRBV10,TRBV19和TRBV23在遗传性CP和特发性CP之间的使用频率存在显著差异;

最终作者统计了不同来源胰腺组织中功能性TCR重排的数量,并分析其与疾病严重程度之间的关系,发现功能性TCR重排的数量与CP中的疾病严重程度呈正相关

3)共性及特征性TCR的发现

最后作者对健康和CP、不同类型CP是否有共性以及特征性的TCR进行了同源性分析,发现至少4名受试者共享20个相同的CDR3β,其中一些仅在遗传性CP患者或仅在CP患者中共享,而其他的则在对照组和CP患者中共享,所以这些序列有作为疾病诊断以及分型标志物的潜力

上述结果表明,CP患者的胰腺组织有着非常不同的TCR免疫组库,同时不同亚型的CP也有自己的TCR特征。

 

总结

本工作中,作者通过收集不同类型CP及对照的胰腺组织,进行流式、Luminex以及TCR-seq分析,发现了CP以及不同类型CP各自免疫微环境的特征:

  • (1)CP中T细胞占比增加;而在特发性CP中,巨噬细胞的比例高于遗传性CP。这一发现表明,不同cp病因介导的免疫细胞亚群可以成为研究不同发病机制的关键因子

  • (2)TCRβ-Seq数据显示CP中T细胞浸润增加,功能性TCR重排和克隆型多样性增加,表明CP中存在多种抗原或多克隆T细胞浸润

  • (3)确定了在遗传性CP或两个CP组之间共享的CDR3β基序,表明局部浸润的T细胞可能存在疾病特异性的抗原

  • (4)TCR重排计数与疾病严重程度呈正相关,这表明TCR组成可能是CP进展和严重程度的预后指标

 

这是一篇典型的临床研究的范例,充分发挥了样本和资源优势。除了样本外,整体的实验设计、实验手段都没有难度,数据挖掘也非常简单。但其带来的临床价值并不逊于精巧严密的机制研究。术业有专攻,对于大部分有研究需求和研究兴趣的临床工作者来说,充分发挥自身优势、不以己之短搏人之长,更有利于临床研究的顺利进行。

 

参考文献:

Lee B., Adamska J. Z., Namkoong H. et al. Distinct immune characteristics distinguish and idiopathic chronic pancreatitis. J. Clin. Invest. 2020, 130(5):2705-2711.