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一个新免疫检查点的发现之旅
2020-06-23

免疫治疗已经成为目前癌症治疗中最有价值的方向之一。肿瘤细胞可以招募大量的免疫细胞到肿瘤组织中,最重要的是肿瘤浸润的淋巴细胞(TIL, tumor infiltrating lymphocytes)。这些TIL由于自身或肿瘤微环境中免疫检查点异常表达,失去了杀伤肿瘤细胞的能力(耗竭)。

目前免疫治疗的主要手段就是使用抗体/药物阻断免疫检查点,从而重新激活耗竭的T淋巴细胞,实现对癌细胞的杀伤。2018年诺贝尔生理或医学奖颁给了免疫检查点(PD-1和CTLA-4)的发现,目前这2个免疫检查点的抑制剂在临床上已得到了广泛的应用。但是目前发现免疫治疗的临床差异很大,不同癌症、同一癌症的不同患者表现出来的疗效差异很大,这说明了肿瘤免疫微环境的复杂性。因此鉴定新的免疫检查点,对癌症免疫治疗就显得至关重要。

图片来源:https://www.nature.com/articles/nrc3239

本文就是通过大数据的分析,鉴定了一个新的T细胞抑制性受体PAC1DUSP2),并对其作用机制进行了系统的研究。让我们一起来看一下作者是如何设计的。

 

1、目标基因筛选和功能验证

为了寻找新的抑制性受体,作者在TCGA数据库中对肝细胞癌的表达数据进行了分析,鉴定与已知的抑制性受体表达高度相关的基因。

  • 结果发现PAC1与已知的抑制性受体的表达高度相关(下图AB)。
  • 作者进一步在结肠癌患者中对PAC1的表达情况进行了分析,发现和肝细胞癌中一样,该基因与已知抑制性受体PDC1和HAVCR2具有相同的表达模式,并且该基因的表达在癌组织和正常组织间的表达没有显著差异,但在外周血单核细胞和TIL中的表达显著上调(下图C)。

 

上述结果表明PAC1可能是TIL中T淋巴细胞耗竭的一个重要基因。因此作者对PAC1对T细胞的功能的影响进行了研究。

  • 细胞实验:

作者构建了野生型及2个磷酸酶活性缺失的突变体的表达载体,并在Jurkat细胞(白血病T细胞系)中稳定表达;进而使用PMA和Ionomycin联合(PI)刺激激活T细胞功能(产生IL2、GZMB等),发现:过表达野生型及突变体,都可以阻止T细胞的激活,这表明PAC1可以抑制T细胞的激活,且不依赖于其磷酸酶活性。

  • 动物实验

作者构建了PAC1敲除(Pac1–/–)小鼠并使用CD3抗体和CD28抗体活化T细胞,发现:与野生型小鼠比较,PAC1-/-小鼠在CD3CD28处理之后,T细胞中GZMB、IFN-γ和TNF表达显著上调,表明PAC1的敲除促进了T细胞的激活。

以上的细胞和动物实验结果表明,PAC1是一个抑制性受体,可以阻碍T细胞激活。既然PAC1能够抑制T细胞的激活,那么这个效应是否能影响宿主抗肿瘤免疫呢?

 

作者使用AOM-DSS(乙氧基甲烷和葡聚糖硫酸钠)模型诱发小鼠结肠癌,并鉴定PAC1在此过程中的作用。结果表明:

  • PAC1敲除后,无论是肿瘤负荷、多样性还是肿瘤大小都出现了显著的降低(下图B),表明PAC1的缺失抑制了肿瘤发生
  • 在野生型小鼠中可见中度分化的结肠腺癌,而Pac1–/–小鼠中只观测到明显的黏膜病变,并伴有明显的淋巴细胞浸润(下图C);
  • 作者在乳腺癌小鼠模型(下图D)、黑色素瘤小鼠模型中进行了相同的检测,都有相同的发现。

这些结果表明:PAC1作为T细胞检查点,减弱CD8+ T细胞介导的抗肿瘤免疫力。那么,肿瘤组织中浸润的T淋巴细胞(TIL)为什么会维持高水平的PAC1表达呢?

 

2、PAC1调控T细胞机制研究

作者认为是肿瘤微环境导致的TIL中PAC1的高表达,因此作者测试了肿瘤微环境的各种特征性的因素包括炎症因子、缺氧、内质网应激、氧化应激和饥饿等对TIL中PAC1表达的影响,发现H2O2诱导的氧化应激特异性激活T细胞中Pac1的表达,说明ROS可能是诱导PAC1表达的因素

  • 作者通过Cl13病毒慢性感染诱导全身ROS产生,再检测PAC1的表达,发现CI13感染可以显著提高PAC1的表达;
  • 为了研究ROS是如何诱导PAC1表达的,作者构建了PAC1不同长度启动子的荧光素酶报告系统,发现转录起始位点上游90-720bp都可以有效响应H2O2(图e);
  • 通过对上述区域进行序列预测,发现在转录起始位点上还有90-100区域存在一个保守的EGR结合位点(图f),通过构建该结合位点以及突变的荧光素酶报告系统,作者发现该PAC1的确通过该motifEGR调控

EGR是一个ROS敏感的转录因子。上述结果表明,ROS可通过EGR诱导PAC1的表达。为了验证这个调控是否存在,作者使用上面的CI13病毒系统在小鼠体内诱导ROS产生,然后比较了PAC1-/-WT小鼠的T细胞的差异。结果表明:

  • PAC1缺失后,表达TNF和IFN-γ的T细胞数目较野生型小鼠有显著提高,说明PAC1在ROS过程中抑制了T细胞的激活;
  • 和前期的报道一致,病毒相关T细胞表达高水平的抑制性受体如PD-1、TIM3、LAG3等。但PAC1缺失之后,这些抑制性受体在病毒相关T细胞中的表达急剧下降,而激活性受体如CD127等表达大幅上升

上述结果表明ROS的确可以通过激活PAC1的表达,从而抑制T细胞的功能那么PAC1又是通过什么机制,调控T细胞功能的呢?

 

 

3、PAC1调控机制的研究

  • 作者首先对PAC1的亚细胞定位进行了研究,发现PAC1定位在细胞核中,而且和染色质结合在一起(下图B)。
  • 该定位是依赖其N端具有核酸结合活性的UBR(unstructured basic region),对UBR进行突变后,PAC1的亚细胞定位从细胞核转移到了细胞质中(下图E)。
  • 继续使用PMA和Ionomycin联合(PI)刺激激活T细胞功能(产生IL2、GZMB等),发现:过表达野生型及磷酸酶活性突变体,都可以阻止T细胞的激活,但UBR突变体则无法抑制T细胞的激活(下图F)。

 

这些结果表明,PAC1通过其N端UBR在染色质上的定位,是其发挥功能的核心

在染色质上发挥功能,最可能的调控机制自然是表观调控了。但是表观调控有很多类型,PAC1究竟是通过与哪个表观修饰因子互作,调控哪些表观修饰呢?

  • 作者首先对PAC1进行了免疫共沉淀co-IP-MS以鉴定与PAC1互作的蛋白,发现核小体重塑脱乙酰酶复合物NuRD)的2个核心乙酰化酶HDAC1和HDAC2均与其有结合,并通过co-IP-WB验证了这些结合是存在的(下图AB);
  • PAC1与NuRD的互作是否有功能呢?作者对野生型以及PAC1突变T细胞中组蛋白的乙酰化水平进行了WB检测,发现PAC1缺失之后,组蛋白的乙酰化水平显著提高。这说明PAC1的确促进了NuRD的去乙酰化功能(下图D)。

整体上PAC1通过NuRD的去乙酰化活性,降低了组蛋白的乙酰化水平,那么T细胞活化相关的基因是否收到了这个调控呢?作者使用Chip-seq对PAC1 KO前后H3K27ac的分布,并使用CUT&Tag对NuRD复合物核心组分CHD4的分布进行了研究,发现:

  • PAC1缺失的确导致了NuRD复合物在GZMB基因上结合的减少,并导致GZMB启动子区的乙酰化水平得到恢复。这说明PAC1通过NuRD调控T细胞激活相关基因的乙酰化水平,从而调控T细胞功能

 

由于组蛋白乙酰化水平会影响核小体构型及染色质开放程度,那么PAC1是否影响了染色质的开放程度呢?作者使用ATAC-seq绘制了染色质开放区域图谱:

  • 和预期的一致的是,大部分发现的开放染色质区域或ATAC峰位于启动子,内含子,和远端基因间区域(下图A);
  • 对不同基因位点的开放性的整体分析发现,PAC1缺失增加了T细胞效应相关基因,包括GZMB的染色质开放程度(下图B,C)。

 

 

综合以上结果可以得出结论:

肿瘤组织浸润的T细胞ROS-EGR1通路激活PAC1的表达,使T细胞逐渐失去效应能力,最终导致T细胞衰竭和抗肿瘤免疫功能减弱在这个过程中,PAC1并没有利用其磷酸酶活性,而是通过N端UBR定位到染色体上,招募NuRD复合物T细胞激活相关基因进行去乙酰化,通过重塑效应T细胞的表观遗传抑制其表达,从而抑制T细胞的活性。

 

参考文献:Dan Lu, Liu, L., Sun, Y. et al. The phosphatase PAC1 acts as a T cell suppressor and attenuates host antitumor immunity. Nat Immunol 21287–297 (2020). https://doi.org/10.1038/s41590-019-0577-9.