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在Science上的文章,实验设计能如此简单?
2020-08-20

目前抑制新冠肺炎(COVID-19)引起的细胞因子风暴成为治疗重症COVID-19患者最重要的手段之一。韩国科学技术院近期在国际期刊Science Immunology上发表了一篇关于新冠细胞因子风暴成因的文章,为驱动疾病恶化的因素提供了新的见解。

研究背景

当病原体(例如致病性细菌、病毒等)感染人体后可引发炎症,机体通过细胞因子介入的炎症反应来抵御病原体的入侵,在该过程中,细胞因子(cytokine),例如IL-2、IL-3、IL-4、IFN-α、TNF-β等,发挥着重要作用。细胞因子风暴(cytokine storm)是指机体感染微生物后引起体液中细胞因子迅速大量产生的现象,会破坏机体的免疫系统平衡,大量的促炎症因子持续产生,最终患者会因自身过度免疫导致多器官功能衰竭。

此前的非典、中东呼吸综合征和埃博拉病毒等感染疾病案例证明,细胞因子风暴才是最厉害的夺命杀手。多数感染新冠病毒(SARS-CoV-2)的患者都只有轻微的症状,例如低热、轻微乏力等;但一些患者却发展成严重的COVID-19,重症COVID-19患者表现出典型的由细胞因子风暴引起的高炎症反应,这也是新冠不同于流感病毒的可怕之处。

 除了样本外,这篇单细胞测序文章的实验设计、实验手段和数据挖掘都简单到令人发指,有一说一,临床医生的样本资源真让人羡慕。那么话不多说,请大家跟随小编一起,看看这篇文章作者是怎么设计的吧。

 

1. 研究对象

研究人员从四名健康供体、八名新冠肺炎患者(轻症或重症)和五名重症流感患者中采集了外周血单核细胞(PBMC)样本,并利用10x Genomics的单细胞RNA测序平台开展单细胞RNA测序(scRNA-seq)。

  • COVID-19和流感的免疫细胞类群一共可分为22簇,根据标志基因可分为13类细胞(下图A,C);

  • 对单细胞转录组数据进行聚类分析发现,聚类结果主要细胞类型和疾病类型相关,证明测序结果的可靠性(下图B);

  • 将患者与正常人免疫细胞分布进行了比较,在流感和COVID-19重症患者中PBMC细胞类群都发生了明显的改变(下图D);在COVID-19中经典单核细胞比例显著提高,而其他细胞相应减少(下图E)。

  • COVID-19和流感的免疫细胞类群一共可分为22簇,根据标志基因可分为13类细胞(下图A,C);

  • 对单细胞转录组数据进行聚类分析发现,聚类结果主要细胞类型和疾病类型相关,证明测序结果的可靠性(下图B);

  • 将患者与正常人免疫细胞分布进行了比较,在流感和COVID-19重症患者中PBMC细胞类群都发生了明显的改变(下图D);在COVID-19中经典单核细胞比例显著提高,而其他细胞相应减少(下图E)

 

 

前面的分析主要就是鉴定细胞类型,接下来作者对scRNA-seq中的差异表达基因进行了分析。

 

2.单细胞转录组差异基因分析

为了比较不同疾病之间的感染影响,研究者根据疾病组与健康组的相对基因表达变化来进行层次聚类。出乎意料的是,结果中 PBMC都按疾病类型而不是细胞类型聚类在一起(下图A)。尽管COVID-19和流感之间有不同的转录特征,但重度COVID-19和流感在单核细胞和树突状细胞中都有相同的转录特征,这反映了重度流感和COVID-19可能存在先天免疫应答的共同机制。

  • NFKB、IRF、CXCR在COVID-19轻重症患者中特异性高表达,TNF、TGF等分子在流感和新冠肺炎中普遍高表达,GO通路分析说明COVID-19中炎症相关分子有明显的激活(下图B);

  • 在COVID-19和流感组中的CD8+T cells和所有类型的单核细胞差异基因数目都显著变多(下图C);

  • 在COVID-19中CD8+T细胞、NK细胞中NFKB1/2、JUN、TNF表达量发生改变,而在单核、DC细胞中IL1B、NFKBID、OSM分子表达量发生改变(下图D);

  •  

 

前面分析了这么多单细胞转录组的数据,那么在COVID-19患者PBMCs中究竟是哪些细胞特异性发挥抗病毒功能呢?在这些细胞中,又是哪些信号通路发生了改变呢?

 

3.CD8+T细胞信号通路分析

研究人员分析了单细胞转录组中表达变化显著的CD8+T细胞和单核细胞进行了分析。

由于CD8+T细胞在抗病毒感染中的重要作用,研究者首先关注了该细胞转录特征,并比较了流感和新冠肺炎之间的差异表达基因,以便寻找新冠肺炎特异性的转录特征,研究结果发现:

  • 在non–EM-like CD8+T cell共鉴定到6簇细胞类型(下图A),其中簇1在流感组中显著富集(下图B),簇3在COVID-19组中显著富集(下图C);

  • 新冠肺炎特异性的基因集中在TNF/IL-1β应答基因上;而流感特异性基因除了TNF/IL-1β应答基因,还集中在IFN-I应答基因上(下图E)。

 

 

上面的结果说明, TNF /IL-1β炎症因子能特异性的上调COVID-19中的炎症反应。那么是否别的炎症因子也能参与其中呢?

 

4.单核细胞信号通路分析

接着研究者又分析了单核细胞的转录谱,对三种单核细胞进行聚类分析,与健康组和流感组相比,比较遗憾的是在COVID-19中没有显著的单核细胞类型富集。作者将流感和COVID-19的单核细胞之间的差异基因进行比较,以寻找COVID-19中特异性表达的基因(下图A,B)。

  • 与CD8+T细胞中类似,TNF/IL-1β在COVID-19中特异性上调(下图C);

  • COVID-19中主要是TNF/IL-1信号通路,而流感中则是I型干扰素通路激活(下图D);在重症COVID-19中IFN-I也起到了重要作用(下图E)。

这时候作者就发现,重症 COVID-19患者的单核细胞中,IFN-I反应与TNF /IL-1β驱动的炎症共存,而在轻度COVID-19患者中则并非如此,那么IFN-I是否是驱动COVID-19重症患者细胞因子风暴的关键因素呢?

 

4.轻症和重症COVID-19中单核细胞比较分析

接下来研究者直接对轻症和重症COVID-19中经典单核细胞进行比较分析,结果发现:
  • 在重症 COVID-19患者多个干扰素刺激基因上调(下图A);TNF和IFN通路均有明显富集(下图B);血浆中IL-6、IL-18等炎性因子表达上调;
  • 对同一病人不同时间点的样品进行细胞分化轨迹分析,轻症期 COVID-19患者TNF /IL-1β、IFN通路激活不显著,而重症期COVID-19显著激活(下图C,E);
  • 根据轨迹分析的结果,与已报道的一个只与TNF有关却不响应IFN的通路一起进行GSEA分析,发现COVID-19重症期患者与其相关性更强(下图G)。

综合以上结果,以上结果说明IFN可能可以增强TNF/NFKB通路,以此高度活化免疫反应。

 

5.普通转录组验证结果

为了证实研究中得到的结论,研究者利用RNA测序分析了COVID-19死亡患者肺部组织转录特征,证实了以上结果:

  • COVID-19死亡患者肺组织和经典单核细胞中,IFITM1, ISG15, 和JAK3表达量上调,RPS18表达量下调(下图A);

  • IFN-I应答和TNF/IL-1炎症反应在肺中显著上调(下图B);

  • COVID-19死亡患者中差异基因与重症患者基因表达显著相关(下图D,E)。

 

 

基于以上数据可以得出,新冠肺炎重症病例炎症反应主要是TNF/IL-1β和IFN-I通路引起,而在轻症患者中只有TNF/IL-1β通路的免疫应答被激活,推测IFN-I通路在COVID-19的炎症恶化中发挥了关键作用。

 

总结
1.首先对样品进行了单细胞测序,分析了其中的免疫细胞类型;
2.对单细胞转录组得到的差异基因进行分析,找到差异基因表达最显著的细胞,以及差异变化显著的基因参与的通路;
3.对这些细胞参与的信号通路进行分析,分析实验组(轻症和重症COVID-19)基因表达的差异,确定造成差异的基因;
4.最后通过普通转录组进行验证。
 
可以看出来,这篇文章的整体逻辑是很简单的,而且在这篇文章发表之前也有不少关于细胞因子风暴对COVID-19病情恶化影响的文章,甚至已经有了一篇COVID-19患者和健康组PBMC的单细胞测序分析文章(Seq-Well平台),在这种情况下还能发表在Science下,看来对于临床研究者来说,研究手段也是很重要的一环。