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如何尽量避免测序后的基因表达量和实验结果对不上?看看Nature和PNAS怎么说~
2020-09-11

可能从来没有人告诉你,转录组测序中存在着不同比例的重复reads,可能会导致测序后的基因表达量和实验结果对不上,所以专业人士一般都会推荐你做绝对绝对定量转录组 (UMI RNA-seq)。

想知道绝对定量转录组在实验中有什么优势?我们先要弄清楚什么是UMI RNA-seq。

Nature Methods和PNAS上的两篇文章都对UMI技术进行了详细的测评,在看这两篇文章前,我们首先来了解一下这项技术的原理。

 

转录组测序中存在的重复reads,其中一部分是文库构建时片段化RNA产生的天然重复,需要被保留;一些是测序过程中PCR扩增不均一性产生的,还有一些是由于测序仪过度扩增引起的,这些重复都需要去除。

 

但是普通转录组技术是无法去除这些重复,导致基因表达定量不准确,这也许就是你抓破头都想不明白为什么测序的结果和实验得到结果对不上的罪魁祸首。

 

UMI RNA-seq可以最大程度上避免这种情况发生,这项技术应用数字标签(digital)技术,在扩增前对每一个片段进行标记,这个数字标签会跟随该片段测序分析的整个过程。

在数据分析时,将具有相同数字标签的重复片段合并,去除PCR扩增及测序仪引起的重复,同时保留天然分子重复,从而还原真实reads组成。

同时UMI RNA-seq还可以纠正扩增测序引入的错误,这项功能可以让CSNP 、RNA编辑等结果更准确。现在小编带大家看看这两篇文章对UMI技术的测评吧~~

两篇文章用了不同的策略来进行UMI的标记

1.PNAS在双端使用了145个固定的UMI,可以产生1452=2万种不同的组合;

2.Nature Method使用了单端10个随机碱基的UMI,可以产生410=104万种不同的组合;

PNAS文章对大肠杆菌全基因组范围内基因使用UMI去重前后Readsdepth的变化进行了对比,发现普通RNA-seq的不均一性更高,使用UMI之后,均一性得到了提高。全局范围内,UMI使用前后depth完全一致的位置很少,说明扩增/测序重复带来的影响是全局性的。

PNAS文章对UMI去重前后,不同表达水平基因表达量的差异进行了分析,发现表达水平中低的基因,受重复的影响较大,且表达水平越低,受重复的影响越大。

两篇文章都在使用UMI与否的情况下,对技术重复的相关性进行了研究:

A.结果都表明,基因表达量越低,重复间的一致性越差,这与我们常规RNA-seq观察到的现象一致;

B.PNAS文章表明使用UMI去重(DPKM)后重复间的相关性显著高于不去重(RPKM),下图中使用UMI去重的点分布更加收敛、相关性也更高;表达量越低UMI的作用越显著;

C.Nature Methods文章直接将同一个cDNA文库扩增了不同循环数,发现不同的扩增引起的重复导致的表达量较低的基因差异非常显著,但使用UMI去重之后,可以将这种差异基本全部消除。

从上面2篇文章的结果来看,UMI去重的确可以消除PCR/测序引入的重复,让测序结果更加准确,并且这种效果对于中低表达量的基因更为显著。

那么康测科技的 UMI RNA-seq效果如何呢?让我们通过数据来说话:

样品相关性:左图为未使用UMI去重、右图为使用UMI去重的结果,可见使用UMI去重之后,基因表达的分布更加收敛,样品间相关性得到了显著提高;意味着UMI的使用可以获得更加准确的基因表达情况。

覆盖度的均一性:从下图可见,使用UMI去重之后,同一个基因不同外显子间覆盖度更加均一。这对可变剪接分析有重要价值。

不同物种的PCR/测序重复情况分析:康测科技统计了执行的数百个UMI RNA-seq项目去重的比例,发现不同物种受重复的影响有一定的差异,总体来讲和基因组的大小呈负相关:动物样品中PCR/测序重复度在10%左右、植物间差异较大,在10-20%之间,微生物的重复度最高、物种间差异最大,在10-30%之间。

从上述的2篇文章可以发现,UMI在RNA-seq中的使用,可以显著提高数据的可靠性、稳定性和准确性。测试数据表明,康测科技的UMI RNA-seq测序产品和文献报道的效果一致、甚至更为优秀。
9月10日-30日,UMI RNA-seq将进行促销活动,用普通的转录组的价格就能享受绝对定量的产品。赶紧抛弃传统的RNA-seq,迎接这一更先进、准确的基因表达研究新技术吧!!

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