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Nature:血液微生物和肠道微生物作用有什么区别?BCR-seq为你解惑!
2020-09-18

引言

细胞抗原受体组库的研究因为测序技术的发展逐步成为研究的热点,而宿主共生微生物在肠道中的定殖对B细胞活化和抗体分泌至关重要,但是目前该方向的研究受限于共生微生物的多样性和B细胞组库的高度个体差异,本文作者采用了一种巧妙的思路简化了上述问题, 很有参考价值哦,下面请大家一起和小编看看这篇文章是怎么做的吧!

 

研究背景

细胞作为构成获得性免疫的重要组成部分,其功能多样性取决于B细胞受体 (B cell Receptor) 重链可变区基因VDJ的重排。大量B细胞抗原识别特异性的集合被称为B细胞抗原受体组库 (B cell repertoire) 。B细胞在粘膜免疫 (mucosal immunity) 系统中主要分泌IgA,而在系统性免疫 (systemic immunity)反应中分泌IgG。

 

近日,Nature上发表了题为Mucosal or systemic microbiota exposures shape the B cell repertoire的文章,运用了单菌可逆定殖对无菌鼠进行不同路径刺激的研究思路,揭示了共生菌是如何塑造B细胞受体组库,在这个过程中系统性免疫和粘膜免疫中B细胞抗原受体组库的差异,揭示出微生物刺激的不同路径(粘膜vs系统)、剂量和顺序对受体组库组成和功能的影响。

实验设计中的生物学材料

  1. 无菌小鼠
  2. 可逆定殖单菌:工程菌只能在体外复制,进入无菌鼠体内由于必需氨基酸合成能力缺陷,会在三天左右时间内消失。(本文研究的设计亮点

结果和主要发现

Part

机体暴露于不同的微生物时,抗体是如何变化的,这取决于这些微生物是留在肠道里,还是进入血液。作者首先利用了上述的基因工程改造的可逆定殖大肠杆菌菌株,分别将其通过灌胃刺激无菌小鼠的粘膜免疫,通过静脉注射刺激系统性免疫,模拟在这两种微生物不同的暴露方式。

接下来对不同组织的B细胞抗原受体组库进行高通量测序(BCR-seq),与无菌对照小鼠进行比较,结果发现:

  1. 同种刺激产生的受体组库CDR3重链的相关性较高,而不同刺激的两组之间的受体组库存在差异(下图a-c);
  2. 使用另一种工程菌梭状芽胞杆菌对上述结果进行验证,证实与菌种无关,受体组库的特征与刺激的免疫路径相关(下图d);

 

现在单细胞测序技术真的可以说得上是炙手可热,这些顶级期刊似乎不做个单细胞测序都说不过去。

本文的作者首先是做了流式分析了B细胞亚群的变化,接着从6只小鼠(2只粘膜免疫刺激组的肠系膜淋巴结,2只系统性免疫刺激组的脾脏,2只对照组肠系膜淋巴结和脾脏)中总共取8个独立的单细胞样品,结果如下:

  1. 利用流式技术对B细胞亚群进行分析,不同的免疫刺激路径对记忆细胞和浆细胞产生了不同的影响(下图e);
  2. 利用10×Genomics平台进行单细胞BCR-seq,对其中的轻链和重链进行联合分析(下图f),以及单独分析轻链和重链(g);发现不同免疫路径受体组库的选择效应与抗体重链相关

综合以上结果,我们可以看出,用单菌株短暂刺激无菌小鼠,不同刺激路径可塑造不同的B细胞受体库,以抗体重链的差异为特征,主要发生在记忆B细胞和浆细胞中

 

Part

那么抗体重链的组成是否是由不同刺激路径引起的呢?因此作者对细菌与抗原结合特征进行了研究。

  1. 肠道内的IgA能最有效地结合大肠杆菌纯化的细菌膜部分,而血清中IgG能同时结合细胞膜和细胞质部分(下图a);
  2. 随着测序深度增加,系统性免疫CDR3多样性在系统性免疫中显著增加,在粘膜免疫中无显著增加(下图b);
  3. 随着粘膜暴露剂量的增加,IgA重链中CDR3克隆型的多样性受到更大的限制,特别是在肠系膜淋巴结;相比之下,脾脏和肠系膜淋巴结中IgG重链的多样性在系统暴露水平较高时得以维持或进一步增加(下图c)
  4. 在IgG记忆和浆细胞中,系统微生物暴露会增加库库多样性,而在IgA浆细胞中,任何一种暴露方式都不会增加库库多样性(下图d)

以上结果说明粘膜免疫主要引起识别细菌膜组分的IgA寡克隆应答,IgA库多样性随细菌剂量增加而减少;系统性免疫则诱导多样化的IgG库,识别细菌膜和胞质组分,其多样性随剂量而增加。

 

为了直接比较免疫球蛋白重链和轻链序列在不同部位的微生物暴露下如何在不同小鼠中进化,作者通过单细胞测序对脾脏中重链和轻链CDR3氨基酸组合方式进行了分析,结果显示:

  1. 系统性免疫组小鼠脾脏的IgG网络中很少有无菌小鼠序列(下图e);
  2. 粘膜免疫组中IgA小鼠肠系膜淋巴结与无菌小鼠共有较多序列(下图f);
  3. 轻链多样性对网络的贡献较小。

对单细胞测序结果分析显示,粘膜系统倾向于基于现存的抗原识别特性来生成新的识别特异性,而系统性免疫则生成全新的高强度识别特异性。

 

Part

对粘膜和系统性免疫系统的免疫特征进行研究发现:

  1. 不同刺激途径均可以启动粘膜和系统性免疫;
  2. 启动这两种免疫反应的阈值存在差异,检测粘膜免疫反应需要106—108 个菌落单位,而系统性免疫只需要105就能被检测到;

所以作者进一步利用可逆定植的大肠杆菌菌株分步分系统进行刺激来研究业已存在的B细胞抗原受体组库对新刺激的反应性。

  1. 先刺激无菌鼠粘膜免疫系统,能大幅提高后续的系统性免疫强度(下图a);
  2. 先刺激无菌鼠系统性免疫并不能降低引发粘膜反应的阈值(下图b);

如果在同一免疫系统中,利用两个可逆定植菌株(大肠杆菌和沙门氏菌)分步刺激,

  1. 粘膜刺激时第2种菌会削弱对第1种菌的IgA应答(下图d,e);
  2. 无论暴露顺序如何,都能增加系统性免疫受体组库IgG的多样性,促进对两种菌的应答(下图h,i)

本文阐释了系统性免疫和粘膜免疫对共生菌反应性的区别的原因,系统性免疫倾向于快速清除细菌感染,所以有反应门槛低(非常少量的细菌就会引发)、反应谱系广(区别对待不同菌株和形成不同的反应性)的特点;反之粘膜免疫反应门槛很高、反应性存在上限瓶颈。这很好的解释了宿主在不同免疫系统中的目的,系统性免疫在机体内快速清除细菌防止可能出现的脓毒血症,粘膜免疫能与肠道中有益菌和平共生,互惠惠利

 

总结

这篇文章最大的亮点就在于运用了单菌可逆定殖对无菌鼠进行不同路径刺激的研究思路,规避了菌群的复杂多样性带来的影响,根据这个设计,后面要做的分析所需的实验手段并不复杂。

在这篇文章中作者特意提及到了一点,由于测序错误会导致测序得到的B细胞受体库结果不准确,很多实验室都采用了不同的策略来提高结果的准确性,在本文作者采用了UMI标签和计算校正的方式来提高了测序的准确性。这些在文章发表时能减少争议的技术手段大家要记得使用呀!!!