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既激活又抑制的奇葩?且看组蛋白乙酰基转移酶的双重调控
2021-07-06 下载

GCN5作为组蛋白乙酰基转移酶被大家所熟知,可以通过影响组蛋白H3K14ac修饰水平正调控基因表达。然而,拟南芥中GCN5在全基因组水平上的转录调控机制还不是很清楚。下面这篇近期发表在核酸研究上的文章表明,GCN5差异调控靶标基因5’和3’端H3K14ac修饰水平,在植物胁迫应答中起到关键调控作用。现在就跟小编一起围观作者是怎么通过ChIP-seq抽丝剥茧,GCN5H3K14ac在全基因上的分布模式,到差异调控靶基因的5’3’端组蛋白乙酰化修饰水平,一步步揭开GCN5激活和抑制基因表达的双重调控机制。

 

 

研究背景和待解决的科学问题

组蛋白乙酰基转移酶(histone acetyltransferaseHAT)、组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylaseHDAC)分别负责乙酰化标记在组蛋白上的沉积、去除,通过调控组蛋白修饰水平改变真核生物中染色质的可及性,介导基因表达激活和抑制的动态转换。拟南芥GCN5作为典型的乙酰基转移酶包含负责催化乙酰化的HAT结构域和靶标结合域bromodomainBRD),参与调节多种发育进程及环境刺激应答。之前的研究表明,GCN5除了催化靶标基因启动子区间的H3K14ac修饰,同时还会影响H3K9acH3K27ac的水平。但是,GCN5介导组蛋白乙酰化修饰调控转录的机制并不完全清楚。

因此,本文想要解决的科学问题,就是想研究GCN5及其介导的组蛋白乙酰化修饰在调控下游靶标基因表达中的作用机制,并进一步解析GCN5在植物生理过程中的调控功能。

 

 

研究思路解析

1GCN5 与转录激活标记H3K14ac在全基因组上的分布模式

前人研究表明GCN5通过催化靶标基因启动子区间的H3K14乙酰化正调控基因表达,为了更加深入研究GCN5的转录调控机制,作者首先采用ChIP-seq实验检测野生型拟南芥中GCN5蛋白在全基因组上的占位与乙酰化修饰分布的关系。

(1)作者通过ChIP seq检测了GCN5H3K14ac,H3K9ac,RNAPIIH3K27me3在全基因组上的富集模式(下图)。结果表明GCN5H3K14ac修饰在在基因上的定位存在很强的一致性;而且GCN5转录激活标记H3K9ac及转录酶RNAPII在全基因上的分布模式呈正相关,与转录抑制标记H3K27me3的分布呈负相关。

 

 

(2)作者进一步对GCN5H3K14ac在靶基因上的富集程度与基因表达水平进行关联分析发现,在高表达基因的转录区域,GCN5的结合区域与H3K14ac修饰区域高度重合(下图BCD)。

 

 

 

(3)通过统计GCN5DNA结合位点在基因功能区的分布,作者发现GCN5的结合位点在靶标基因Promoter区和5’UTR区均有显著的富集,与H3K14ac不完全一致(下图D)。

 

 

(4)作者对GCN5结合位点进行分析发现,GCN5promoter区的识别位点是典型的顺式作用元件G-BOX (CACGTG)(下图左motif234),表明GC5识别组蛋白乙酰化修饰外,还可被转录因子招募到靶标基因的启动子区。

 

 

作者通过上述ChIP-seq实验和分析,表明GCN5可能通过影响H3K14ac的修饰正调控基因表达,同时阐明了GCN5在靶标基因功能区的分布模式。

 

2. GCN5可以通过调控H3K14ac的分布水平激活或抑制基因的表达

(1)为了进一步研究GCN5调控基因表达的机制,作者设置gcn5(缺失突变体)与野生型作为差异比较分组,通过ChIP seqmRNA seq技术,分析GCN5的结合靶标基因及表达调控靶标基因。突变体VS野生型的差异基因中,表达下调基因占比高达60%,而且这些下调基因中大部分也被ChIP seq鉴定为GCN5的靶标基因(下图AB)。

 

 

但是,令人意外的是,上调的基因集中,也有70%左右的基因属于GCN5结合靶标基因。因此,作者推测GCN5也可能作为转录抑制子调控基因表达

 

(2)为了验证GCN5负调控基因是否也与H3K14ac修饰相关,作者检测了GCN5突变对其靶标基因H3K14ac修饰水平的影响。结果表明GCN5突变导致其靶基因5’端的H3K14ac的修饰水平显著降低;但无论是在野生型还是突变体中,H3K14ac在靶基因的3’端均有富集(下图CD)。

 

 

(3)为了进一步解析GCN5在转录调控中的激活和抑制的双重调控机制,作者分别分析了H3K14acGCN5上调和下调靶基因集上的分布模式(下图EF)

 

 

H3K14ac的修饰水平在GCN5突变导致的上/下调靶基因上的分布模式不同:gcn5突变体下调基因5’端的H3K14ac修饰水平显著降低,而3’显著升高

上述实验表明,GCN5通过调控H3K14ac在靶基因5’3’区修饰水平,激活或抑制靶标基因的表达。

 

3GCN5作为转录抑制子参与SA信号通路介导的植物免疫应答

作者通过ChIP-seq分析了GCN5影响组蛋白修饰水平,调控了靶标基因的表达,那么GCN5作为转录调节因子是如何影响植物的生理进程呢?

(1)GO富集分析发现突变体下调基因主要富集在多种非生物胁迫应答通路;上调基因主要富集到生物胁迫应答通路,包含植物免疫应答调控关键通路水杨酸(salicylic acid, 以下简称SA)信号通路。

 

 

(2)作者进一步解析GCN5如何参与调控SA稳态及免疫应答响应。作者比较了病菌在宿主拟南芥中的增殖情况,发现gcn5突变体较野生型中病菌的繁殖能力显著降低(下图B);同时,gcn5突变体叶片衰老程度显著低于野生型(下图C)。这些结果反映出gcn5突变体对病原菌侵染的抵抗力较野生型显著增强

 

 

(3)由于SA信号通路在植物抗病反应中起正调控作用,而GCN5突变增强了植物对病菌的抵抗能力。因此作者进一步检测了GCN5SA信号通路的影响:

  • 通过SA定量检测发现GCN5突变导致植物体内SA水平显著上调(下图D);
  • qPCR检测发现突变导致SA信号通路的负调控因子(WRKY33等)表达水平显著下调(下图F);

 

 

(4)作者进一步证明GCN5通过H3K14ac修饰调控SA信号通路中关键调节因子WRKY33等的表达。

  • GCN5正调控WRKY33DND2MYC2基因的H3K14ac的修饰水平(下图G);
  • ChIP-qPCR表明WRKY33DND2MYC2GCN5的结合靶标基因(下图H);

 

 

 

  • 可视化图直观展示了GCN5蛋白及H3K14acWRKY33DND2MYC2基因上的富集(下图)。

 

 

综上所述,作者通过ChIP-seq发现GCN5差异调控下游靶标基因5’3’端的H3K14ac修饰水平,激活或抑制植物应答通路关键调控因子的表达,揭示GCN5在植物分别在生物和非生物胁迫刺激应答中扮演着双重调节子的身份(下图)。

 

 

 

总结

本文通过对GCN5H3K14ac ChIP-seq数据进行关联分析,首次揭示了GCN5差异调控H3K14ac在靶标基因5’3’端的修饰水平,结合mRNA数据分析证明GCN5通过H3K14ac修饰调控基因转录的机制,并解析了GCN5作为关键调控因子在植物胁迫应答中的作用。

虽然GCN5作为乙酰基转移酶扮演转录激活因子的身份为大家所熟知,但是作者对GCN5的转录调控机制的探究并没用囿于通常认知的桎梏,反而通过ChIP-seq技术GCN5H3K14ac全基因组上的富集模式中发现GCN5参与抑制调控的线索。广大研究植物转录调控机制的小伙伴们,不妨学习本文作者的研究精神,深挖数据,小心求证,说不定就发现不一样的烟火呢~

 

参考文献:Soonkap Kim et al. GCN5 modulates salicylic acid homeostasis by regulating H3K14ac levels at the 5′ and 3′ ends of its target genes, Nucleic Acids Research, 2020.