不少老师在实际研究中遇到一个棘手的问题：自己所关注研究的物种由于不够“热门”，没有可用的参考基因组数据，从而难以进行高通量转录组测序的研究。

针对这一问题，人们结合高通量测序数据开发出了无参转录组的分析方法，使得“冷门”物种的转录组学研究成为了可能。下面，小编通过这项采用了康测UMI无参转录组技术发表在Tree Physiology的研究工作来为大家介绍无参转录组的研究思路。

摘要：三叶崖爬藤是一种具有观赏价值和药用开发潜力的藤本植物，其块根又名“三叶青”，一直是传统中药材。然而，块根的形成需要很长的时间，故作者以三叶崖爬藤的三种根——须根（FR），条状根(BR)和块根(CR)为材料，通过生化实验，切片观察分析的手段，再结合无参转录组数据揭示了三叶崖爬藤根形态转化的机制。

一、不同类型根中生长素等物质含量差异明显

三叶崖爬藤的生长过程中，首先形成的是须根，之后逐渐形成条状根。在三到五年的生长后，三叶崖爬藤会形成块根，条状根，须根共存的状态。作者首先检测了其中具有药用价值的黄酮类化合物以及生长素IAA的含量。如图1所示，结果显示块根中，黄酮类化合物含量显著高于其他类型根，而生长素的含量则正好相反，在须根中含量最高，在块根中含量则很低。

图1

二、三种根切片的特征

切片作为最经典的生物学研究手段，能够直观展示不同组织/细胞的结构差异。作者通过切片观察了三种根的结构特征，发现在须根（图2A）中，具有完整维管束结构，而在条状根(图2B）中这一结构则部分退化，块根中(图2C）的维管束则进一步高度退化。另一方面，番红固绿染色结果则显示，从须根到块根的发展过程中，多聚糖类物质积累逐渐增多，表现在胞质中出现了更多的颗粒（深绿色），这与块根的药用价值相关。总结上述结果，块根中相较于其他根类型积累了更多次生代谢物质。

图2

三、无参转录组分析不同类型根中的差异转录本

由于三叶崖爬藤并没有可用的参考基因组，作者选用了康测UMI无参转录组的方法来对RNA-seq数据进行分析：将UMI去重后的clean reads通过Trinity软件进行组装，得到转录本序列，对其进行注释。再采用与有参转录组分析相同的方法，筛选差异表达转录本并分析其聚类。结果如图3中所示，其中有158个差异转录本是三种类型根两两比较所共有的，而这其中又有57个转录本在须根-条状根-块根这一发育过程中保持着一致的变化趋势，故作者推测这57个差异转录本与块根的形成关系紧密。

图3

通过将这些差异转录本与数据库进行比对，作者发现其中有部分转录本编码植物细胞壁扩展蛋白（expansins），而目前研究显示这一蛋白家族与细胞伸长生长的关系紧密，可能在三叶崖爬藤也参与调控了块根的形成（图4）。同时作者注意到在须根中，WAT1相关蛋白的表达量上调和CYP83B1的下调可能导致了生长素IAA含量的上调。此外，ACC氧化酶表达量的上调则会导致植物内源乙烯含量的下调。在两种激素含量变化的共同作用下，根生长发育得到了促进。

图4

对三种类型根之间的差异转录本进行GO/KEGG聚类分析（图5），作者发现诸多次生代谢物质的生物合成与代谢，WRKY家族转录组因子，以及植物激素信号转导等通路都很可能参与了三叶崖爬藤块根的形成。

图5

总结：

目前，随着生物学研究水平的全面发展，即使是比较冷门的生物研究，也很难仅靠展示表型或生理生化实验数据来发表研究论文。而结合转录组数据，对表型进行解释分析，以及为机制研究提供思路或指引，仍然是冲击高水平期刊的利器。本篇文章的研究内容很好地结合了切片观察（表型），激素/黄酮类含量（生化数据）以及无参转录组的数据，对三叶崖爬藤块根的发育形成做出了可能的解释。值得一提的是康测的UID无参转录组分析，为这些尚无基因组数据的物种提供了更为精确可靠的转录组数据分析方法！

参考文献：https://academic.oup.com/treephys/advance-article-abstract/doi/10.1093/treephys/tpab024/6144573?redirectedFrom=fulltext