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结直肠癌治疗新靶标?RIP-seq解析假尿苷合成酶调控癌细胞增殖机制
2021-08-13 下载

RIP-seq通过免疫沉淀目标蛋白捕获蛋白结合RNA,获得RNA结合蛋白在体内结合RNA的动态变化,是研究RNA转录后修饰调控基因表达机制的重要研究工具。近年来,RIP-seq在癌症病理相关分子机制研究中屡建奇功。

下面这篇近期发表在Advanced Science上的文章中,作者通过shRNA文库联合RNA-seq筛选到结直肠癌组织中异常表达基因,发现DKC1参与结直肠癌预后调控,进一步通过RIP-seq确认DKC1结合包括RPS3在内的多种核糖体蛋白的编码mRNA,通过假尿嘧啶(ψ)修饰增强mRNA稳定性,促进肿瘤细胞增殖,还结合药理实验揭示DKC1可以作为结直肠癌治疗新靶标。文章思路清晰,非常值得学习借鉴。

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研究背景和待解决的科学问题

结直肠癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一,其发病率在我国患癌新发病例中高居第三。靶向药物治疗是结直肠癌重要治疗方法,因此研究结直肠癌的候选治疗靶标可以为抗肿瘤治疗提供重要的理论基础。

Dyskerin假尿苷合成酶1(Dyskerin pseudouridine synthase 1,DKC1)基因编码的Dyskerin具备假尿苷合酶功能,能够结合并催化靶标RNA的尿苷(U)异构化为假尿苷(Ψ)。DKC1在多种癌症中表达失调,并与患者预后相关。但是DKC1在结直肠癌相关的作用机制尚不清楚。

本文想要解决的科学问题,是通过解析DKC1在结直肠癌中如何通过RNA修饰调控基因表达、影响结直肠癌的进展,探讨DKC1作为结直肠癌的候选治疗靶标可能性

 

研究思路和结果

  • DKC1正调控结直肠癌(Colorectal Cancer,CRC)细胞增殖

为了鉴定参与结直肠癌进展的必需基因,作者通过shRNA文库结合高通量测序,筛选CRC相关候选基因集,并利用NEST软件分析鉴定了包括DKC1在内的肿瘤增殖相关基因(下图A标注,其余5个均是功能已知的调控肿瘤生长的关键基因)。

为了解析DKC1在CRC中的作用机制,作者首先构建了DKC1敲除细胞系,通过WB和qPCR验证了shDKC1细胞系中DKC1的基因和蛋白表达水平均显著下调(下图B)。

 

 

作者通过多种实验检测敲低DKC1对CRC增殖能力的影响:

1)通过比较细胞增殖曲线发现,shDKC1较对照增殖速率显著降低(下图C);

 

 

2)细胞克隆形成实验表明敲低DKC1会导致CRC细胞克隆数目显著降低(下图D);

 

 

3)敲低DKC1会显著降低hCRC类器官数目和大小(下图F)。

 

 

上述结果表明DKC1正调控CRC细胞的增殖,在结直肠癌进程中可能起到了关键作用。

 

  • DKC1正调控CRC增殖依赖其假尿苷合酶活性

为了确认DKC1对CRC细胞增殖的调控是否取决于其假尿苷合酶活性,作者在shDKC1细胞系中分别回补正常功能的DKC1和无活性的突变DKC1(D125A),用于分析酶活对CRC细胞增殖的影响。

作者通过验证Western blot,确认了恢复细胞系中酶的表达(下图A);

细胞增殖曲线(B)和细胞克隆形成(C,D,E)实验发现,DKC1回补可以恢复敲低细胞系的增殖能力,而D125A由于缺乏假鸟苷合酶活性,无法恢复shDKC1细胞系的增殖能力;

 

 

体内肿瘤增殖实验(下图F)和免疫荧光检测肿瘤标志基因Ki67表达实验结果(下图G)显示,DKC1可以——而D125A不能——恢复shDKC1中肿瘤的增殖能力。

 

 

作者检测DKC1的抑制剂唑夫喃菌素(pyrazofurin, PF)对CRC细胞增殖(下图H)及类器官数目(下图I)的影响,发现细胞增殖能力与DKC1的活性正相关。

 

 

上述结果表明,DKC1调控CRC肿瘤细胞增殖能力依赖于其假鸟苷合酶活性,施加抑制剂PF可以抑制CRC增殖。

 

  • 蛋白组学及qRT-PCR分析鉴定DKC1下游靶标基因

作者通过蛋白组学检测DKC1敲低对蛋白表达的影响,以鉴定DKC1可能的下游调控靶标蛋白。

比较shDKC1和shCTL的蛋白组学数据筛选到172个差异表达蛋白(下图A),GO和KEGG富集分析发现大多数差异表达的蛋白质都属于核糖体蛋白。

 

 

定量qPCR检测发现,五种核糖体蛋白(RPL10A、RPL22L1、RPL34、RPS3、RPS9)的mRNA丰度在shDKC1中的变化与蛋白质组学数据一致,表明这些核糖体蛋白的mRNA和蛋白表达可能受DKC1调控。

 

 

重新引入DKC1,可以恢复敲低DKC1导致的核糖体蛋白mRNA(下图E)和蛋白水平(下图F)的降低,表明这些核糖体蛋白的调控依赖于DKC1。

 

上述结果表明,DKC1正调控部分核糖体蛋白。

 

  • RIP-seq实验证明DKC1结合并促进靶标核糖体蛋白mRNA的稳定性。

作者采用RIP-seq实验来鉴定DKC1的mRNA结合位点,下图A统计了peak在基因不同功能区域的分布占比,大部分在外显子区域;另外,作者通过RIP-seq鉴定了DKC1三个新的motif(下图B);

 

 

Reads coverage可视化结果表明,DKC1结合RPS3等核糖体蛋白基因(下图C);RIP-qPCR也验证了DKC1蛋白对RPS3等核糖体蛋白基因的富集(下图D)。

 

 

作者通过双荧光素酶报告系统来验证DKC1与RPS3的结合能力:通过比较shDKC1与shCTL的荧光强度,证实DKC1与RPS3结合,且依赖于RPS3 mRNA上已知的假尿苷修饰位点Ψ1182。

 

 

进一步检测mRNA的半衰期发现,DKC1对RPS基因的mRNA稳定性至关重要。

 

上述结果表明,DKC1结合RPS3等核糖体蛋白的mRNA,通过假尿苷修饰维持mRNA的稳定性,进而提高蛋白的表达。

 

  • 核糖体蛋白介导DKC1的致癌活性

既然DKC1调控靶标核糖体蛋白,那么这些核糖体蛋白是否参与DKC1介导的CRC细胞增殖过程呢?为了回答这个问题,作者构建了RPS3等核糖体的敲低细胞系,分析CRC细胞增殖的情况。

在(shDKC1+DKC1)细胞系中敲低核糖体蛋白后,过表达DKC1对细胞增殖(下图A)和克隆形成(下图B)的促进作用显著降低。

 

 

过表达DKC1靶标核糖体蛋白可以促进shDKC1细胞生长:敲低DKC1导致的CRC细胞增殖(下图C)、克隆形成(下图D)和肿瘤生长(下图E)的缺陷均被RPS3等核糖体蛋白的高表达挽救。

 

 

 

上述结果表明,DKC1下游靶标RPS3等核糖体蛋白参与调控CRC细胞增殖。

 

  • DKC1抑制剂PF和MEK抑制剂Trametinib协同抑制CRC肿瘤细胞生长

为了进一步研究核糖体蛋白在CRC增殖中的功能,作者从已报道的RPS3抑制下游ERK信号通路入手,检测了DKC1靶标的核糖体蛋白对ERK磷酸化活性的影响。

敲低DKC1和核糖体蛋白会抑制ERK1/2的磷酸化水平(下图A);同理,使用DKC1抑制剂PF会提高ERK1/2的磷酸化水平(下图B);

 

 

CoIP实验验证了核糖体蛋白RPS3等与下游靶标HRAS的直接相互作用,表明RPS3等核糖体蛋白通过结合HRAS参与RAS/RAF/MEK/ERK信号通路。

 

 

同时施加PF和MEK抑制剂Trametinib协同抑制CRC细胞活力(下图F,G)和肿瘤生长(下图H,I);

 

 

上述结果表明,DKC1下游靶标核糖体蛋白可以通过结合HRAS参与ERK1/2信号通路调控,DKC1抑制剂PF和MEK抑制剂Trametinib协同抑制CRC肿瘤细胞生长。

 

 

  • DKC1高表达与不良预后相关
      1.  

人源CRC组织和细胞中DKC1和相关核糖体蛋白表达水平较正常组织显著升高(下图A~C);

 

 

      1.  

TGAC数据分析发现DKC1与RPS3等核糖体蛋白表达呈正相关;

 

 

免疫化学染色表明,在CRC临床样本中,DKC1有着很高的表达量,而且高表达的DKC1病例的无进展生存期更差。

 

 

上述结果表明,DKC1高表达与CRC不良预后正相关。

 

 

总结

本文通过shRNA文库筛选到CRC相关候选基因DKC1,通过RIP-seq确认了DKC1介导的假尿嘧啶修饰调控核糖体蛋白mRNA稳定性,正调控CRC细胞增殖。通过Co-IP证实DKC1正调控的RPS3表达能够结合并抑制H-Ras,从而抑制MEK-ERK信号通路。药物实验表明Pyrazofurin治疗的同时联合使用MEK抑制剂trametinib具有显著的协同抗癌效果。这些研究为结直肠癌治疗提供了新的潜在治疗靶标。

 

文献链接:https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202004344