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植物中m6A阅读蛋白通过调控polyA位点选择影响硝酸盐代谢
2021-08-27 下载

  • 研究背景

m6A甲基化修饰作为真核生物mRNA上最为普遍的修饰,参与多种重要的生命活动。m6A甲基化阅读蛋白(Reader)可以特异识别具m6A修饰的RNA,但关于Reader的相关研究主要集中在哺乳动物中,而在植物中m6A及其Reader的调控机制相关研究相对较少。不仅如此,此前已发现m6A修饰可通过影响mRNA的定位、剪接、降解及翻译等过程来调控基因的表达,但m6A修饰如何影响mRNA polyA位点的选择,来调控相关基因的表达,还知之甚少。

本研究要解决的科学问题,就是探究拟南芥中潜在的甲基化阅读蛋白CPSF30-L是否同m6A修饰有关?若有关,CPSF30-L所介导的m6A调控的具体分子机制又是怎样的?一起来看看与康测合作的老师做的漂亮研究吧。

 

1. CPSF30-L是拟南芥的甲基化阅读蛋白

由于YTH domainm6A甲基化阅读蛋白(Reader)的典型结构域,因此作者首先检查了CPSF30-L是否包含该结构域。对拟南芥CPSF30-L及其同源蛋白的结构域进行分析发现,拟南芥的CPSF30-LAtCPSF30-L)具有3zinc fingers1YTH domain,而人、鼠、果蝇等动物中的CPSF30-L同源蛋白并无YTH domain(下图A)。

此前研究发现含YTH domainReader可以结合具m6A修饰的RNA5’ -RGACH- 3’

motif),为了探究CPSF30-L是否是真正的Reader,作者通过等温滴定量热(ITC)实验进行了探究,发现CPSF30-L与具m6A修饰的RNA有很高的亲和力,而与无m6A修饰的RNA亲和力仅为前者的十分之一(下图B),暗示CPSF30-L确实是Reader

 

 

作者接着对CPSF30-L-m6A RNA复合体进行了共结晶并解析其结构(下图C),与其他具YTH domainReader蛋白类似,发生甲基化修饰的腺嘌呤(A)可插入CPSF30-L的疏水口袋中(下图D)。而这一疏水口袋具三个保守的氨基酸残基:Trp310, Trp259, 以及Tyr319,除此之外,Ala260, Asn249, Thr261, Asp356等残基也在识别甲基化核酸的过程中发挥重要作用,且这些氨基酸残基在不同物种中保守存在(下图E)。YTH domain(CPSF30-L)-m6A RNA分子间的相互作用也表明CPSF30-L的确是Reader(下图F)。为了更好的证实这一结论,作者将识别CPSF30-L中识别m6A修饰的关键氨基酸参基进行了突变(Trp310, Trp259, Tyr319→Ala310, Ala259, Ala319),突变后的蛋白与具m6A修饰RNA的亲和力大幅下降(上图B)。这些结果表明,CPSF30-L是真正的m6A reader

 

 

2. CPSF30-L调控全局polyA位点的选择

此前研究已发现,CPSF30-L在可变的polyA位点(APA)的选择中发挥重要作用,因此作者通过PAS-seq检测野生型、cpsf30-2突变体拟南芥中polyA位点的使用情况,结果发现cpsf30-2突变体中具不同polyA位点的基因更多(下图B表明CPSF30-L可大范围调控polyA位点的选择此外,作者还在cpsf30-2突变体中分别回补了CPSF30-L、失去m6A识别能力的CPSF30-L蛋白(YTH结构域关键位点突变),并进行PAS-seq,发现CPSF30-L能使polyA位点情况恢复野生型水平,而YTH结构域关键位点突变的CPSF30-L不能,表明YTH结构域对APA的发生至关重要

 

 

不仅如此,由于m6A修饰可影响包括polyA位点选择在内的mRNA加工过程,而CPSF30-L不仅是m6A Reader,还可大范围调控APA发生,因此作者怀疑CPSF30-L可能是通过识别m6A修饰调控APA。为了验证这一猜测,作者对野生型、cpsf30-2突变体拟南芥进行了meRIP-seq,检测其中的m6A修饰情况meRIPPAS-seq联合分析发现,存在m6A修饰的RNA在突变体中更容易发生APA(下图D),且cpsf30-2突变体polyA位点距m6A修饰更远(下图E, F)。上述结果表明,CPSF30-L介导的APA依赖于其m6A识别能力

 

 

3. CPSF30-L通过影响APA调控硝酸盐代谢相关基因

此前研究以发现,CPSF30-L是硝酸盐信号传递过程中的重要一员,它可以通过调控硝酸盐传感器NRT1.1的表达,来介导硝酸盐信号的传递,且PAS-seq也显示,发生APA的基因富集到了硝酸盐响应、硝酸盐转运相关的通路,因此作者推测CPSF30-L可能通过识别m6A修饰,介导硝酸盐信号相关通路上靶标RNAAPA发生

为了验证这一推测,作者选择了硝酸盐信号相关通路中的几个基因(NRT1.1, WRKY1, GLN1;1, GLN1;3)进行验证,这些基因的RNA上均存在m6A修饰,且均可使用不同的polyA位点(下图A, C, E, G),不仅如此,上述RNAcpsf30-2突变体中表达量发生了明显改变(NRT1.1, WRKY1显著下调,而GLN1;1, GLN1;3显著上调),但回补CPSF30-L蛋白可使突变体中靶标RNA的表达量恢复至野生型水平(下图B, D, F, H)。

 

 

 

此外,作者还进行了生理实验,通过NRP-YFP拟南芥响应外界硝酸盐时根部会发荧光的特点,来验证CPSF30-L蛋白的作用:将幼苗用硝酸盐培养基培养5天后,cpsf30-2突变体根部的荧光明显低于野生型,在突变体中回补CPSF30-L可使其荧光强度恢复至野生型水平,而回补丧失m6A识别能力的CPSF30-L蛋白(W259A, W310A, Y319A)的拟南芥荧光强度仍远低于野生型(下图A, B)。

 

 

而硝酸盐响应通路的改变,使cpsf30-2突变体硝酸盐含量大幅降低,硝酸盐还原酶活力、氨基酸含量显著增加,而在突变体中回补CPSF30-L,可使上述表型恢复至野生型水平,但回补丧失m6A识别能力的蛋白(W259A, W310A, Y319A),植株表型仍同突变体类似(下图C, D, E)。这些结果均表明,CPSF30-Lm6A识别能力可介导APA的发生,从而调控硝酸盐信号通路中的靶标RNA

 

 

综上,作者发现拟南芥中的蛋白CPSF30-Lm6A Reader,该蛋白的m6A甲基化修饰的识别能力,可介导APA的发生,进而调控硝酸盐代谢相关的靶标RNA表达,从而影响拟南芥的氮素代谢过程。

 

研究思路小节:

  • 生信预测、蛋白结构解析及ITC等证实CPSF30-Lm6A reader
  • PAS-seq+meRIP-seqRT-qPCR证明CPSF30-Lm6A识别能力可介导靶标RNA polyA位点的选择;
  • 生理实验等表明CPSF30-L可调控硝酸盐代谢相关的靶标RNA表达,从而影响拟南芥的氮素代谢过程。

 

参考文献:

[1] Hou Y ,  Sun J ,  Wu B , et al. CPSF30-L-mediated recognition of mRNA m6A modification controls alternative polyadenylation of nitrate signaling-related gene transcripts in Arabidopsis[J]. Molecular Plant, 2021, 14(4).