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胚胎干细胞中内源性逆转录酶和核糖核酸酶介导的抗病毒机制
2021-10-28 下载

 

名词缩写和解释:

mESCs小鼠胚胎干细胞

MEF小鼠胚胎成纤维细胞

脑心肌炎病毒(EMCV)一种在细胞质中复制的单链RNA病毒

小鼠肝炎病毒(MHV)属于冠状病毒科β冠状病毒属,单链RNA病毒。

内源性逆转录病毒(ERV)在哺乳动物的基因组中,存在大量逆转录病毒序列,称为内源性逆转录病毒(ERV),由逆转录病毒感染、病毒基因组逆转录和整合事件引起。

 

研究背景

基于核酸的防御系统在抗病毒过程中发挥着重要作用,例如,CRISPR/Cas采用RNA引导的DNA切割来防止DNA噬菌体感染RNA干扰(RNAi)采用RNA引导的RNA切割来防御RNA病毒感染的。在哺乳动物细胞中,当面临病毒感染时,基于干扰素(IFN)的先天免疫提供了第一道保护。然而,早期胚胎和多能干细胞,包括胚胎干细胞(ESC),在病毒感染期间产生IFN有缺陷,并且它们对IFN治疗的反应也尽管如此,干细胞仍能抵抗病毒感染。因此,干细胞如何应对病毒感染是一个有趣且具有挑战性的问题。最近,有报道证明干扰素刺激基因 (ISG) RNAi通路与ESC病毒感染有关。 然而,通过敲除生产siRNADicerRNAi 缺陷干细胞对病毒感染的抵抗力反而更强表明ESC中可能存在其他复杂的抗病毒机制本研究报道了一种新型的基于核酸的抗病毒系统,在小鼠胚胎干细胞(mESCs)中,通过DNA介导的RNA切割来抑制RNA病毒感染值得一提的是,文中单链DNA建库测序工作是康测协助完成的哦。快来跟随小编了解作者是如何一步步发现这个新的抗病毒机制的吧~

 

 

研究思路

1. 内源性 RTase 能够抑制 mESC 中的病毒感染

作者首先脑心肌炎病毒EMCV感染mESC(E14TG2a和D3)和小鼠胚胎成纤维细胞(MEF) 结果表明,MEF相比,mESC细胞系对EMCV的感染更具抵抗力(图1amESC中观察到的RTase活性明显高于MEFBHK21等体细胞(图 1bmESCs在分化后几乎失去了RTase活性(图 1c)。

 

 

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接着,作者通过RTase抑制剂叠氮胸苷(AZT)来研究内源性逆转录病毒 ERVRTase活性mESC抗病毒免疫的影响结果表明,AZT处理显著增加了EMCVRNA和蛋白质水平(图2de),并且还增加了受感染细胞的比例和病毒滴度(图 2fg)。这说明AZT 处理显著增强了EMCV的细胞病变效应表明RTase能显著影响mESC抗病毒功能。

 

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之后,作者进一步测试了AZT 对小鼠肝炎病毒 (MHV) 的影响结果显示AZT处理能显著促进mESCs中的MHV增殖(图3kl),表明内源性RTase的抗病毒功能也适用于其他RNA病毒此外,作者通过LSD1一种组蛋白H3赖氨酸4脱甲基酶抑制MESCs和早期胚胎中ERV 的表达抑制剂GSK-LSD1处理mESCs结果表明,GSK-LSD1处理显著降低了mESCEMCVRNA、病毒蛋白和病毒滴度的水平(图 3h-j),而且MHV的感染也受到 GSK-LSD1处理的抑制(图 3kl)。

综上,说明内源性 RTase能显著抑制mESCRNA病毒感染

 

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2. 内源性RTase引起受感染mESC细胞质中产生病毒DNA

有报道表明,哺乳动物细胞中还存在非逆转录RNA病毒的DNA 形式接下来,作者测试了mESC中的RTase活性是否引起EMCV感染后病毒DNA (vDNA)的合成结果表明,感染后12小时就可以在mESC中检测到vDNA 4a。此外,在病毒感染后mESCsMEFBHK21等体细胞产生更多的vDNA(图 4b),并且在mESCs分化后vDNA的水平显著降低(图 4c)。相应地,AZT处理有效地抑制了vDNA的产生(图 4d),GSK-LSD1处理增加了vDNA水平(图 4e)。因此,作者推测vDNA的产生可能是mESCRTase抗病毒功能的原因。

随后,作者对vDNA进行了亚细胞定位(4f)DNA荧光原位杂交(DNA FISH证实了vDNA定位于细胞质(图 4g总的来说,这些结果表明,病毒感染后mESCs中的RTase可以使细胞质中的病毒RNA产生vDNA,这种vDNA可能限制病毒复制。

 

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3. vDNA与病毒RNA形成 DNA/RNA异源双链

作者接下来通过处理只能切割双链DNAdsDNADNA限制性核酸内切酶BsrB1Mfe1研究vDNA的性质(图 5a结果表明,在限制性核酸内切酶处理后含有EMCV基因组的质粒pCMV-rNJ08PCR产物显著减少,而vDNAPCR产物不受影响 5b 此外vDNA对特异性消解ssDNAS1核酸酶敏感(图 5c)。之后,作者通过使用正链或负链引物进行单向引物PCR延伸来确定vDNA相对于病毒基因组RNA极性结果表明,在正链引物(p5-Fp6-F)延伸中,PCR 产物的数量显著减少(图 5d这意味着dsDNA的形成。这些结果表明vDNA主要由与病毒基因组RNA互补的负链ssDNA组成命名为vcDNA

接着,作者用特定探针富集了vcDNA,并通过深度测序分析研究vcDNA沿病毒基因组的分布。如图5e所示,vcDNA序列沿病毒基因组分布并不均匀,与基因组3'部分匹配的reads数更多。作者假设它可能DNA/RNA染细胞中的病毒RNA杂交的形式存在之后通过特异性识别DNA/RNA杂交结构的单克隆S9.6抗体检测(图 5f,以及DNA-RNA免疫沉淀 (DRIP) 实验5gh), 最终验证了vcDNA主要存在于DNA/RNA异源双链体中,与受感染mESC中的病毒RNA起存在。

 

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4. RNase H1对未分化mESCvcDNA的抗病毒功能至关重要

由于RNase H识别和切割DNA/RNA杂交体RNA作者之后测试了内源性RNase H1是否参与了mESCvcDNA的抗病毒功能。首先,作者发现受感染mESC中的DNA/RNA杂交体与细胞质中的RNase H1共定位 6a);其次,使用RNAscope(一种高度灵敏的 RNA 原位杂交分析)确定了病毒RNA细胞质中的RNase H1共定位(图6b第三vcDNA可以被病毒感染的mESCRNase H1抗体免疫沉淀(图 6c)。这些结果表明内源性RNase H1vcDNA和病毒RNA形成的异源双链招募

 

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接下来,在病毒感染前,作者通过siRNA敲低RNase H1的表达来评估RNase H1是否可以调控抗病毒感染结果表明,RNase H1耗竭显著促进了mESCEMCVMHV的感染,但未影响ISG的表达(图7d-f)。为了进一步研究RTaseRNase H1介导的抗病毒过程之间的关系,作者在病毒感染前用AZTGS K-LSD1处理了RNase H1耗尽的 mESCAZTRTase活性的抑制显著了病毒感染,并且在AZT处理后RNase H1敲低未能进一步促进病毒增殖,表明RNase H1在内源性RTase下游发挥功能7gh)。相比之下,敲低RNase H1 可以部分消除GSK-LSD1的抑制效果(图7ij)。此外,RNase H1的过表达抑制了病毒感染,而失去活性的RNase H1突变体对mESC中的病毒感染没有影响(图7k-m)。这些结果表明RNase H1参与mESCRNA病毒复制限制机制,且处于内源性RTase下游。

 

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总结

在这项研究中,作者揭示了mESC中以前未表征的抗病毒机制。病毒感染后,内源性RTase将病毒RNA逆转录为vcDNA,形成由vcDNA和病毒RNA组成的DNA/RNA杂交体。异源双链体招募RNase H1,后者水解杂交体中的病毒RNA从而抑制病毒复制。 作者将这种类型的抗病毒机制命名为ERASE(内源性RTase/RNase H介导的抗病毒系统),这意味着入侵的RNA病毒可以被ERASE擦除(图8a)。研究结果首次证明,内源性RTase和RNase H组合通过产生与病毒基因组互补的vcDNA在天然抗病毒防御中发挥作用切割病毒RNA。因此,ERASE代表了另一种基于核酸的抗病毒防御机制是对已知抗病毒机制的补充(图8b)。

 

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内源性RTase和RNase H在防御mESCRNA病毒感染的作用意味着源自病毒RNA的DNA可能具有抗病毒防御功能。本研究结果为mESCs的抗病毒机制以及内源性逆转录病毒和细胞RNase H的抗病毒功能提供了有趣的新洞见也为研究RTases和逆转录元件在广泛生物体中的抗病毒功能提供了基础。

 

参考文献

Wu J, Wu C, Xing F, et al. Endogenous reverse transcriptase and RNase H-mediated antiviral mechanism in embryonic stem cells[J]. Cell Research.