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工程化外泌体修复受损细胞内吞作用并减轻椎间盘退变
2021-10-29 下载

 

研究背景

椎间盘退变(intervertebral disc degenerationIDD)是引起下腰痛的主要原因,开发IDD的有效治疗措施是椎间盘研究中的焦点之一。干细胞治疗是实现组织修复的重要手段之一。

外泌体(EVs)是间充质干细胞 (MSC) 治疗肌肉骨骼退行性疾病——包括椎间盘退变——的潜在治疗方式。通常,EVs被内化,传递生物活性分子,使受体细胞发生表型变化。为了在 IDD 治疗中有效利用EVs,了解EVs摄取的机制至关重要。

20219华中科技大学同济医学院附属协和医院杨操教授团队ACS Nano发表研究论文Engineering Extracellular Vesicles Restore the Impaired Cellular Uptake and Attenuate Intervertebral Disc Degeneration”,该项研究探索了干细胞来源外泌体髓核细胞(nucleus pulposus cellsNPCs内吞机制及其在椎间盘退变治疗中的应用。康测的转录组测序帮助老师验证了一个重要假设哦,让我们一起先睹为快吧~~

 

研究结果

 

1. MSC共培养系统改善TNF-α处理的NPCs细胞焦亡

作者首先利用TNF-α处理NPCs,如下图A所示,作者通过WB检测了焦亡标志蛋白50 ng/mL TNF-α处理下不同时间点的表达量,发现其中的cleaved caspase-1 (C-caspase-1)GSDMD-NNLRP3蛋白表达量相对对照组显著增加,且与处理时间正相关

 

 

为了进一步研究MSCsNPCs的治疗作用,作者构建了如下图B所示的细胞间接接触共培养模型。通过该共培养系统,作者检测MSCs共培养可显著降低NPCsC-caspase-1GSDMD-NNLRP3的表达,且随着共培养时间的增加,这种治疗效果更加明显。同时如下图DE所示,免疫荧光分析表明MSC共培养组的细胞焦亡率也显著降低,且与共培养时间呈反比。

 

 

 

随后,作者使用特异性抑制外泌体分泌试剂GW4869处理MSCs,如下图F所示焦亡相关蛋白表达量升高,确定抑制外泌体分泌会破坏MSCsNPCs中共培养的治疗效果。同时如图GH所示,免疫荧光分析也显示GW4869处理增加共培养组NPCs细胞焦亡率

 

 

 

以上结果表明,外泌体可能介导了MSC共培养的治疗效果,但其具体机制有待进一步研究。

 

2. MSC来源的外泌体抑制TNF-α诱导的NPCs细胞焦亡。

为了确认EVs的效果,作者EVsMSC培养基中分离孵育NPCs,与对照组(PBS不含EV培养基CM培养的NPCs相比,EVs处理组降低TNF-α处理的NPCsC-caspase-1GSDMD-NNLRP3的表达下图A),免疫荧光分析也同样发现与EVs孵育显著降低NPCs细胞焦亡率下图B

 

 

此外,作者发现TNF-α处理的NPCsPeroxiredoxin-2 Prx2,过氧化物酶2的表达水平降低,而在添加EVs培养时则显著升高(下图D,说明Prx2被输送到NPCs

 

 

为了进一步研究Prx2的作用,作者利用siRNA敲低基因,WB检测发现EVs-si-Prx2C-caspase-1GSDMD-NNLRP3表达水平高于EVs-si-scr(下图EF),免疫荧光分析也显示,EVs-si-Prx2处理组相比EVs-si-scrNPCs细胞焦亡率显著升高(下图GH)。

 

 

这些结果表明Prx2EV介导的治疗效果中发挥作用同时EVsPrx2水平的降低一定程度上影响了NPCs的治疗效果。

 

3. 降低NPCsEVs的吸收对不利于治疗

TNF-α预处理NPCsEVs孵育,发现EV孵育对焦亡相关蛋白的表达水平影响不大(下图AB流式细胞仪的检测结果也表明TNF-α-24hTNF-α-36h组中标记的NPCs率降低,表明EV吸收受损(下图CD)。

 

 

 

这些发现表明,TNF-α处理降低了EVs吸收不利于治疗

 

4. 细胞吸收EVs依赖于Caveolae介导的内吞作用

为了阐明EVs吸收的机制,作者使用不同的胞吞通路抑制剂处理NPCs通过PKH-26标记EVs并与NPCs孵育后流式细胞仪检测发现,加入氯丙嗪(chlorpromazine可阻断网格蛋白介导的内吞作用)青霉素 (wortmannin磷酸肌苷3-激酶的抑制剂)EVs吸收几乎没有影响而胆固醇合成动力蛋白抑制剂dynasore和辛伐他汀simvastatin)的添加可显著降低NPCsEVs的吸收(下图AB)。

 

 

因此作者推测caveolae/lipid可能参与了EV的内化过程为了验证这一假设,作者利用RNA-seq,分析TNF-α处理不同时间点NPCs基因表达情况(下图C),如图DGO富集分析显示差异下调基因与脂质代谢过程、肝素和糖胺聚糖结合相关有力支持了作者此前提出的猜想

 

 

基于RNA-seq结果,作者进一步进行EVs吸收的机制探究,发现TNF-α处理的NPCs中,凹陷蛋白相关蛋白2Caveolae associated protein 2Cavin-2的表达显著降低co-IP分析结果表明,在NPCs中,Cavin-2Caveolin-1结合(F)。同时作者构建了敲低Cavin-2NPCs (E),并利用流式细胞仪检测发现Cavin-2敲低显著降低EV吸收(下图G&H)。

 

 

这些结果表明,NPCsEV吸收是由依赖caveolae内吞作用介导的,而Cavin-2在这一过程中发挥了关键作用

 

5. 改造EVs可使受损NPCs重新获得治疗效果

为了修复NPCs的内吞通路,作者利用基因编辑技术设计了改良EVs构建了Cavin-2表达载体,并将其转染到MSCs(下图A)。

 

 

作者从对照MSCs (C-EVs)和转染Cavin-2MSCs (M-EVs)中分离出EVs,如下图BC所示,检测发现C-EVsM-EVs的形态和尺寸分析无显著差异WB检测细胞和EV部分的Cavin-2蛋白水平,表明Cavin-2M-EVs表达(下图D)。

 

 

为了评估C-EVsM-EVsNPCs的影响,作者检测TNF-α预处理的NPCs细胞焦亡相关蛋白的水平下图E),并利用免疫荧光下图F和流式细胞仪检测下图G,进一步评估NPCs胞外细胞内吞作用的差异,表明M-EV组的内吞吸收率高于C-EV

 

 

这些结果表明,Cavin-2工程改造的EVs能够恢复NPCs的细胞内吞作用的吸收功能,对受损NPCs具有更好的治疗效果

 

6.改良EVs在三维水凝胶中恢复NPCs的囊泡吸收

作者构建了三维海藻酸水凝胶体外培养模型,模拟体内Cavin-2改造的EVsNPCs的影响(下图A),利用该模型,作者发现在TNF-α受损NPCs中对C-EVsM-EVs吸收率不同下图B)。同时,基于标记EVs荧光强度分析,TNF-α未处理的NPCsC-EVsM-EVs吸收率相似。而与M-EVs相比,TNF-α处理的NPCsC-EVs吸收显著减少C)。

 

 

作者在该模型中评估了EVs孵育的NPCs的细胞活力,与此前结果一致,TNF-α治疗可诱导NPCs死亡,C-EVsM-EVs均可部分挽救TNF-α的效应。与C-EVs相比,M-EVsTNF-α处理的NPCs上表现出较低的死亡率(下图G)。

 

 

综上所述,M-EVs能够恢复受损NPCs囊泡吸收能力

 

7. EVs改造工程体外椎间盘培养模型治疗效果

作者研究了Cavin-2改造的EVs是否能够在椎间盘退变治疗中发挥作用。在离体椎间盘培养模型中,整个椎间盘器官被分离并在培养基中培养,这使得能够使用外部添加剂在器官水平检测(下图A)。作者一周内重复EV注射程序体外成像显示C-EVsM-EVs在椎间盘内留存超过一周下图B

 

 

此前的研究发现退变椎间盘的特征是髓核区域缩小纤维环伴纤维破裂。作者通过苏木精伊红(HE)和藏红花素O-fast green (S-O)染色观察大鼠椎间盘髓核和纤维环的形态和细胞稀疏性。这些组织学染色结果量化后发现TNF-α导致大鼠椎间盘的退行性病变,给药C-EVsM-EVs可延缓IDD进展(7F)M-EVsIDD的治疗效果优于C-EVsTUNEL分析结果表明C-EVs相比,M-EVs更明显地降低了TNF-α诱导的细胞死亡(7H)

 

 

总之,这些数据表明,在体外模型中,工程改造的EVs具有更好的椎间盘退变治疗效果

 

研究结论

本项研究发现干细胞外泌体通过递送抗氧化蛋白可缓解髓核细胞焦亡,减缓细胞的损伤与退变。然而,细胞功能下降的髓核细胞对干细胞外泌体表现出较低的摄取效率,极大地影响细胞外囊泡的治疗效率。进一步研究发现,Cavin-2在髓核细胞内吞外泌体的过程中发挥重要作用,Cavin-2的丢失导致髓核细胞对外泌体内吞效率降低。通过对母体干细胞改造,获得表达Cavin-2的工程化外泌体,此类囊泡可有效恢复髓核细胞对外泌体的摄取效率,提升此类细胞外囊泡在椎间盘退变中的治疗效果。该研究探索了髓核细胞对干细胞来源外泌体的吸收机制,并设计了内吞性能优化工程化外泌体用于椎间盘退变的治疗,为细胞外囊泡在椎间盘损伤修复领域中的应用提供新的思路。

 

 

A,炎症环境下髓核细胞NPCs内吞途径受损,对外泌体的吸收效率降低,致使外泌体治疗效率下降;B,工程化外泌体可改善髓核细胞的内吞活性,增加细胞对外泌体的细胞吸收量,进而提升外泌体在椎间盘退变中的应用效果)

 

参考文献

Liao Z, Liu H, Ma L, et al. Engineering Extracellular Vesicles Restore the Impaired Cellular Uptake and Attenuate Intervertebral Disc Degeneration[J]. ACS nano, 2021.