研究背景和待解决的科学问题

 

神经母细胞瘤(NB)是儿童最常见的颅外恶性肿瘤，因其进展迅速、死亡率高，占儿童肿瘤相关死亡的15%以上。对于对于高危NB患者，临床治疗中面临巨大挑战。之前的研究表明，代谢重编程导致了NB的发生和侵袭，但其内在调控机制仍不清楚。

环状RNA(circRNAs)是一类闭合连续环路RNA，可以充当miRNA海绵或RNA结合蛋白伴侣，在肿瘤相关的基因表达调控中发挥关键作用。虽然一度被归为非编码RNA (ncRNAs)一个类别，但近期研究发现某些circRNA具备编码肽段或蛋白质的能力，同样参与调控肿瘤相关生理过程。

为了探究NB进程中代谢重编程的机制和相应的治疗方法，作者通过血清剥夺实验模拟代谢重编程过程，筛选参与NB代谢调控的候选因子，结果发现ecircCUX1编码的P113促进NB进展。那么p113如何调控这一过程呢？下面就跟小编一起来学学作者的解题思路吧。

 

研究思路和结果

 

一、血清剥夺处理促进NB中CUX1基因的环状RNA编码的p113蛋白的表达。

作者首先采用定量蛋白质组学（iTRAQ）检测NB细胞在血清剥夺（Serum deprivation，SD）处理响应过程中蛋白表达的变化，以获得调控代谢重编程的关键因子。作者通过一系列实验确认了ecircCUX1编码的p113蛋白表达受SD胁迫调控：

1. 在两种NB肿瘤细胞系中，SD处理分别导致了381和145个蛋白表达显著改变，热图（下左）展示了两种细胞系变化趋势一致的蛋白。

2. 进一步与Genomatrix数据库中转录因子类型蛋白集合取交集（下右韦恩图），共筛选到4个SD胁迫响应的候选蛋白（CUX1，HOXC4，REL和TCF3）。

 

3. 采用WB验证SD处理对CUX1和TCF3的表达的影响，结果表明CUX1的主要亚型[p200, p110或选择性剪接产物(CASP)]和TCF3的表达均未受SD处理影响，而p113(CUX1的一种新亚型)在SD处理后上调程度与时间呈正相关（下图）。

 

4. 质谱分析获得了p113亚型的氨基酸序列，序列比对发现蓝色标记序列（下图）分别来自于CUX1的10和11号外显子，红色的序列来自于 hsa_circ_30402（下文称为ecircCUX1）。

 

5. 作者采用反向引物扩增及测序验证了ecircCUX1的核酸序列，确认ecircCUX1编码蛋白亚型P113；

 

6. 为了进一步确认ecircCUX1编码蛋白产物，作者构建了外源过表达ecircCUX1及对照Mut(ORF终止突变)细胞系（下图左）， WB结果显示，包含完整ORF的细胞系可以表达p113（下图右）。

 

7. 作者进一步通过CRISPR/Cas9基因编辑技术直接在CUX1的9号外显子上（exon 9）分别插入3xFLAG和终止密码子（下图g），构建FLAG-KI和Mut-KI细胞系，用WB验证了ecircCUX1 RNA对p113的编码能力（下图h）。

 

上述结果表明，在NB细胞中，SD胁迫诱导ecircCUX1编码的p113蛋白的表达。

 

二、p113蛋白的表达水平在NB肿瘤中显著上调，进而促进胞内脂肪酸氧化和线粒体活性。

明确了NB细胞中ecircCUX1编码蛋白p113的表达受到SD诱导，那么p113的表达与SD诱导的代谢重编程之间是否存在关联呢？为了解答这个问题，作者构建了多组p113过表达和敲低细胞系，检测其表达水平与代谢稳态之间的关系。

 

1. 通过检测p113在肿瘤组织和细胞中的表达谱，作者发现NB标本和细胞株中p113表达水平较正常组织和细胞中显著升高（下图a），且与NB患者生存率负相关（下图c）。

2. 作者挑选H-SY5Y, SK-N-SH, BE(2)-C和IMR32四个p113本底水平不同的NB细胞系作为实验样本，构建了相应的 p113过表达(ecircCUX1)、突变（ecircCUX1 Mut）和敲低(sh-ecircCUX1)细胞系（下图b）。

3. 同时，p113的亚细胞定位主要在细胞核（下图c,d），暗示其可能参与了转录调控。

4. 为了检测p113对代谢的影响，作者从SD相关的脂质代谢入手。脂质代谢质谱分析发现过表达CUX1D导致细胞中长链脂肪酸产量增加（下图e）。其中，棕榈酸(C16:0)、棕榈油酸(C16:1n7)、油酸(C18:1n9c)、硬脂酸(C18:0)和花生四烯酸(C20:4n6)的水平显著增加，而敲低ecircCUX1则会产生相反的效果(下图f)。

5. 作者进一步探究p113对脂肪酸代谢的下游线粒体活性的影响，分别检测过表达和敲低细胞系对外源油酸诱导的代谢响应，包括耗氧率（oxygen consumption rate ，ORC），NAD+/NADH比值和ATP水平（下图g,h），结果发现p113表达水平与线粒体活性正相关。

上述结果表明，NB细胞中p113表达显著上升，会促进其胞内脂肪酸氧化代谢和线粒体活性。

 

三、P113与ZRF1和BRD存在物理互作，在NB细胞中形成三聚体复合物发生作用。

为了研究P113蛋白功能，作者从转录调控机制作为切入点，通过RNA-seq筛选下游靶标基因，同时通过CoIP筛选与p113直接互作的转录调控因子。

 

1. RNA-seq结果显示，过表达p113的SH-SY5Y细胞中有460个基因上调，1695个基因下调（下图a）。

2. CoIP-MS鉴定与p113互作的蛋白，并与ChIP-X和EpiFactor数据库中的转录因子及表观遗传因子进行overlap分析，获得7个候选互作蛋白（下图b）。

3 作者进一步聚焦于其中唯一的转录因子ZRF1和转录辅助因子BRD4。Co-IP实验结果表明，p113与ZRF1和BRD4直接互作；过表达或敲低p113会相应增加或降低三者的相互作用。两步法免疫沉淀也证实了p113分别与ZRF1或BRD4结合。

 

 

4. 分别通过CRISPR沉默ZRF1或BRD4均可以消除p113与ZRF1或BRD4的相互作用(下图h)。

5. 双分子荧光互补BiFC实验显示，p113与ZRF1和BRD4存在物理相互作用，而ZRF1和BRD4之间没有相互作用(下图e)，表明p113与ZRF1和BRD4形成了如下图i所示三聚体。

上述结果表明，p113在NB细胞中与ZRF1和BRD4物理结合形成三聚体复合物。

 

四、p113/ZRF1/BRD4复合物促进NB细胞脂质代谢重编程和线粒体复合物I活性。

为了进一步研究p113/ZRF1/BRD4复合物的靶标基因，研究其调控代谢重编程机制，作者使用ChIP seq实验筛选DNA结合蛋白ZRF1和BRD4靶标结合基因，结合RNA seq鉴定的p113调控基因，筛选到三组共同的靶标基因进行了功能分析。

1. 转录因子ZRF1的ChIP seq分析结果显示，peak在TSS附近显著富集，在promoter-TSS存在一定占比，同时也鉴定到ZRF1的结合motif。这些结果符合转录因子的结合特性，反映出ChIP seq实验结果的准确性。

 

 

2. ChIP seq与RNA seq联合分析筛选到46个靶标基因，通过韦恩图和热图及功能富集分析，发现其中包含与代谢通路和Complex I合成相关的基因ALDH3A1，NDUFA1和NDUFAF5（下图）。

 

 

3. IGV可视化显示ZRF1和BRD4在靶标基因ALDH3A1，NDUFA1和NDUFAF5的启动子区域存在富集（下图b）。

4. ecircCUX1的异位表达导致SH-SY5Y和SK-N-SH细胞中ALDH3A1、NDUFA1和NDUFAF5蛋白水平升高，敲除ZRF1或BRD4后则表达水平降低（下图c）。

 

 

5. 在稳定过表达ecircCUX1的SH-SY5Y细胞中，敲低ZRF1或BRD4的能部分消除OCR、长链脂肪酸产量、线粒体膜电位、复合物I活性、NAD+/NADH比值和ATP水平升高的效果（下图）。这与三聚体复合物的靶标基因ALDH3A1、NDUFA1和NDUFAF5的蛋白水平变化情况相一致。

 

 

6. ZRF1的异位表达增加了ALDH3A1、NDUFA1和NDUFAF5的表达（下图b），并导致OCR水平、线粒体膜电位、复合物I活性、NAD+/NADH比值、ATP水平升高（下图c-d），而敲低ALDH3A1、NDUFA1或NDUFAF5则能部分消除这些变化。

综上所述，p113/ZRF1/BRD4复合物通过调控靶标基因ALDH3A1、NDUFA1和NDUFAF5的表达，进而促进NB细胞脂质代谢重编程和线粒体复合物I的活性。

 

 

五、p113通过与ZRF1相互作用促进NB细胞肿瘤的发生和侵袭。

为了进一步探索了p113和ZRF1在NB进展中的协同作用，作者在体外NB细胞增殖实验及肿瘤转移动物模型实验中进行了研究。

1. 敲低ZRF1显著抑制了稳定过表达ecircCUX1诱导的NB细胞的体外生长和侵袭 (下图a, b)

 

 

2. 敲低ZRF1显著抑制过表达ecircCUX1对肿瘤转移及生长的促进作用。

作者采用尾静脉注射异种移植肿瘤模型，通过检测肿瘤转移增殖指标探索CUX1和ZRF1对NB肿瘤细胞的作用：

a. 体内成像显示敲低ZRF1抑制了过表达ecircCUX1诱导的皮下异种移植瘤的增殖 (下图c)；

b. 免疫组化染色显示Ki-67标志增殖指数和CD31标志的微血管数目受到CUX1和ZRF1的正调控(下图d);

 

 

c. 肿瘤体积和重量增长曲线也反映出CUX1对肿瘤生长的促进依赖于ZRF1（下图）；

 

 

d. 过表达ecircCUX1会使得小鼠模型出现更多的肿瘤细胞肺转移集落和更低的生存率，敲低ZRF1会消除这一影响（下图）。

这些结果表明，p113通过与ZRF1的相互作用促进了NB细胞肿瘤的发生和侵袭迁移。

 

六、阻断p113-ZRF1的相互作用能抑制NB进展。

 

1. 作者设计靶向阻断p113和ZRF1之间相互作用的抑制性细胞穿透肽（ZIP-12），下图左展示了其三维结构和序列，阴性对照组Ctrl改变了穿透肽序列。

 

 

2. 对穿透肽进行亚细胞定位发现，ZIP-12在细胞核内有明显的聚集，而阴性对照Ctrl无法入核（下图）。

 

 

3. CoIP结果显示，ZIP-12能够与内源性p113蛋白结合，并消除NB细胞中p113和ZRF1之间的相互作用，但对p113和BRD4的相互作用没有影响。

上述结果表明，通过设计抑制肽，可以消除p113和ZRF1的相互作用，那么ZIP12对NB细胞的增殖影响如何呢？

 

4. ZIP-12处理的BE(2)-C细胞的长链脂肪酸水平、线粒体膜电位、复合体I活性、NAD+/NADH比值、ATP生成都有所下降（下图）。

 

 

5. 静脉注射ZIP-12可以抑制BE(2)-C细胞在裸鼠体内形成的皮下异种移植瘤的荧光信号、体积、重量、Ki-67增殖指数和CD31阳性微血管量（下图）。

 

 

6. 静脉注射ZIP-12导致较少的肺转移肿瘤集落（下图左），并延长了尾静脉注射BE(2)-C细胞处理的小鼠的生存时间（下图右）。

上述结果表明，阻断p113-ZRF1的相互作用可以抑制NB进展。

 

六、CUX1、ZRF1、BRD4及其靶标基因与肿瘤患者的不良预后有关

 

1. 作者分析了498例NB病例的转录组数据，发现高表达p113宿主基因CUX1、ZRF1、BRD4、ALDH3A1、NDUFA1或NDUFAF5与患者的总生存率低相关。

2. 在这些NB患者中，ZRF1与其靶标基因ALDH3A1、NDUFA1或NDUFAF5的表达也呈正相关性（下图b）

这些病理样本数据表明，CUX1、ZRF1、BRD4及其靶标基因与肿瘤患者的不良预后有关。

 

总结

本项研究发现，由CUX1的circRNA编码的p113，可以促进NB细胞脂质代谢重编程、线粒体活性、肿瘤增殖、侵袭和转移。进一步研究表明，p113与ZRF1和BRD4相互作用形成转录调控复合物，并介导ZRF1/BRD4的转录激活。通过ChIP seq和RNA seq联用鉴定到转录复合物的靶标基因ALDH3A1、NDUFA1和NDUFAF5，这些基因参与调控脂肪酸醛转化为脂肪酸、脂肪酸β氧化和脂肪酸β氧化等脂质代谢过程，而抑制肽阻断p113-ZRF1相互作用可抑制NB肿瘤细胞的发生和侵袭性及代谢重编程。以上调控机制和抑制肽作用的模型总结于下图，为研究NB肿瘤治疗方案提供了新思路。

文献链接：https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-021-01421-8