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多手段联合揭示circRNA翻译产物蛋白的促癌机制
2021-11-22 下载

 

研究背景

环状RNAcircRNA一类由真核细胞产生,通过反向剪接(back splice),使线性RNA53连接,形成共价闭合的环状结构,且在物种间高度保守。起初,circRNA被认为是mRNA加工或错误剪接的副产物,但近期研究发现, circRNA 可被翻译为未知蛋白亚型。 同时,m6ARNA修饰最丰富的类型,能够促进circRNA翻译为蛋白质。但是,在人类癌症研究中,编码蛋白的circRNA实验数据较少。

在本研究中,作者发现了一种新型环状RNA-circARCARHGAP35,源于肿瘤抑制基因ARHGAP35,并经常在癌组织中上调。这个circRNA是否在癌症发生发展中有作用?如果有,作用机制又是什么呢?接下来,就跟随小编一起来看看作者的研究思路吧。

 

研究结果

一、circRNA鉴定

为了鉴定肝癌中重要的蛋白编码的circRNA,作者做了以下工作:

1. 作者挑选12对肝细胞癌组织和癌旁组织,对其进行circRNA-seq。差异分析显示,177circRNAHCC中下调表达,16circRNAHCC中上调表达(下图A)。

 

2. qPCR分析显示,由ARHGAP35基因23号外显子反向剪接形成的circARHGAP35HCC中上调表达,其对应的ARHGAP35基因下调表达(下图B)。

 

3. 荧光原位杂交(FISH)验证了circARHGAP35主要定位在细胞质中(下图F)。

 

4. 作者通过Northern blot(下图G)、RNase R消解(下图H)、放线菌素D处理(下图I)等实验均证实,circARHGAP35是环状RNA

二、circARHGAP35具有促癌作用

circARHGAP35在癌组织中上调,那么它是否能促癌呢?为了回答这个问题,作者做了一系列体外和体内实验。

1. qRT-PCR显示,在HuH-7HCT-116细胞中,敲低circARHGAP35显著抑制了细胞增殖(下图B)和细胞的迁移和侵袭能力(下图CD);敲低ARHGAP35对细胞增殖并没有影响(下图B),但是促进了细胞的迁移和侵袭(下图CD)。同时敲低circARHGAP35ARHGAP35,细胞增值、迁移和侵袭无显著变化(下图CD)。

 

2. 在裸鼠异种移植模型中敲低circARHGAP35,发现敲低circARHGAP35的小鼠肿瘤更小(下图IJ),肺转移比例更低(下图KL)。而线性ARHGAP35的过表达显著抑制了HCT-116细胞的致瘤性肺转移能力。

 

综上所述,circARHGAP35和线性ARHGAP35在肿瘤中发挥相反的作用:circARHGAP35促进肿瘤细胞生长、侵袭和转移,而线性ARHGAP35作为肿瘤抑制因子,抑制细胞迁移和侵袭。

 

三、circARHGAP35具有蛋白编码能力

既然circARHGAP35起到促癌作用,那么它的机制是什么呢?作者首先从其蛋白编码能力着手:

1. 通过TRAP技术和质谱分析发现,circARHGAP35与蛋白翻译相关的EIF3IEIF2S1相互作用(下图AB)。

2.  RIP-qPCR验证了circARHGAP35EIF3I之间的相互作用(下图C)。

 

 

3. 序列分析显示,circARHGAP35存在一个3867nt的开放阅读框(ORF),含有宿主基因的起始密码子和终止密码子(下图D)。

 

 

4. 作者构建Flag标签融合载体和阴性对照,通过Western blot检测发现成环的circARHGAP35可以被翻译出蛋白(下图E)。使用识别ARHGAP35circARHGAP35蛋白共有的N端序列抗体做Western blot,观察到p-circARHGAP35p-circARHGAP35-Flag质粒都在ARHGAP35蛋白带下方有特定的蛋白带(下图E)。

 

5. 为进一步验证内源性circARHGAP35蛋白的存在,作者使用N端识别抗体进行Co-IP,观察到了源自circARHGAP35蛋白的特定肽片段(下图F)。

 

以上结果说明circARHGAP35具有蛋白编码能力

 

四、circARHGAP35的翻译受m6A修饰调控

前期有研究报道,m6A修饰可以促进细胞中circRNA的翻译,circARHGAP35的翻译是否受到m6A修饰的调控呢meRIP-qPCR显示,circARHGAP35存在m6A修饰(下图I);过表达去甲基化酶FTO后,circARHGAP35m6A修饰水平和蛋白表达显著下降(下图JK),说明m6A修饰对circARHGAP35的翻译非常重要

 

 

五、circARHGAP35的翻译产物具有致癌作用

circARHGAP35是以RNA形式,还是以蛋白的形式发挥作用呢为了评估circARHGAP35蛋白的生物学功能,作者构建了与circARHAPGAP35相同ORF的线性模型(下图AB)。作者发现circARHGAP35蛋白能够驱动癌细胞的集落形成和增殖,而ARHGAP35蛋白的影响很小或没有影响(下图CD),此外,circARHGAP35蛋白增加了癌细胞系的迁移和侵袭能力,而ARHGAP35蛋白的作用则相反(下图E)。这些结果证明,circARHGAP35的蛋白产物能够促癌

 

六、circARHGAP35蛋白与细胞核中的TFII-I相互作用

那么,circARHGAP35蛋白是通过什么机制促进癌症发展的呢?接下来,作者对circARHGAP35促进肿瘤进展的下游机制进行了研究

1. ARHGAP35包含4FF结构域和一个CRhoGAP结构域,而circARHGAP35蛋白缺乏RhoGAP结构域(下图A)。

2. 免疫荧光检测显示circARHGAP35定位于细胞核,ARHGAP35定位于细胞质(下图B)。

3. ARHGAP35蛋白的异位表达显著抑制了RhoA的活性,而circARHGAP35蛋白对RhoA的活性没有显著影响(下图C)。

 

4. 有研究报道转录调控因子TFII-IFF结构域之间存在相互作用。作者通过Co-IP证实了TFII-IcircARHGAP35蛋白结合(下图FG)。

 

 

5. 细胞增殖和迁移侵袭实验表明,过表达circARHGAP35蛋白可促进癌细胞的增殖和迁移侵袭,但是,干扰TFII-I后,效果显著下降(下图H-J),说明circARHGAP35蛋白主要通过TFII-I发挥促进癌细胞增殖和迁移侵袭的作用

 

七、HNRNPL调控环状circARHGAP35的形成

下游机制清楚了,那上游又是什么分子在调控circARHGAP35

1. 作者通过RNAi63种与RNA剪切有关的蛋白进行沉默。其中,HNRNPL的沉默导致了circARHGAP35的下调,对线性ARHGAP35没有影响,符合前期的研究结果(下图AB)。

 

2. eCLIP-seq数据显示,HNRNPL结合位点位于circARHGAP35位点的两侧。RIP-qPCR结果表明,HNRNPLcircARHGAP35显著富集,特别是位于intron1intron3内的UP1Down2(下图CD)。

 

3. 基于这两个位点,作者构建了报告基因(下图E)。发现敲低HNRNPL后,成环效率显著降低(下图F),进一步证明了这两个位点对circARHGAP35的调控作用。

 

4. 此外,在HCC中,HNRNPL上调(下图G),且与circARHGAP35呈正相关(下图HI),与线性ARHGAP35不相关。

 

综上所述,HNRNPL促进了circARHGAP35RNA表达,HNRNPL高表达水平导致了HCCcircARHGAP35的上调

 

八、circARHGAP35的上调与癌症患者生存率差相关

研究circARHGAP35在癌症中的潜在临床意义,作者在110HCC癌旁组织中检测了circARHGAP35和线性ARHGAP35的表达

1. HCC中,circARHGAP35表达显著上调(下图A),线性ARHGAP35表达下调(下图C)。

2.  Kaplan-Meier生存分析显示,高表达circARHAPGAP35与较短的总生存期(OS)、较短的无病生存期(DFS)和较高的复发率相关(下图E),而高线性ARHGAP35表达的患者有更好的预后(下图F)。

3. 结合circARHGAP35和线性ARHGAP35的表达时,高circARHGAP35水平和低线性ARHGAP35水平的患者OSDFS更短,复发率更高(下图G)。

 

研究总结

1. 作者鉴定到了一种来自肿瘤抑制基因ARHGAP35的新型环状RNA circARHGAP35,体内外的功能实验显示circARHGAP35具有促癌作用,而ARHGAP35则有抑癌作用;

2. circARHGAP35在起始密码子附近含有多个m6A的修饰,促进其被翻译成蛋白;

3. circARHGAP35蛋白通过结合TFII-I发挥其促癌作用,而ARHGAP35通过降低RhoA活性抑癌;

4. 通过对RNA结合蛋白的筛选,发现HNRNPL能促进circARHGAP35的生成,且在circARHGAP35成环序列两侧存在结合位点。HNRNPL高表达导致了HCCcircARHGAP35上调。

5. circARHGAP35的上调与与较短的总生存期、较短的无病生存期和较高的复发率相关。

文章链接:https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/advs.202001701