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淋巴瘤新靶点?ChIP seq解析转录因子BATF3及靶标基因IL-2R的促癌机制
2021-12-22 下载

超级增强子(Super enhancer, SE)作为成簇的转录激活顺式调控元件,在癌症发生、细胞分化、免疫应答等重要生理过程中发挥关键作用。因此,利用ChIP seq鉴定肿瘤细胞中超级增强子元件,进而筛选关键调控因子,是一种高效肿瘤机制研究手段

下面有这篇近期发表在Nature communications上的文章, 就是运用ChIP seq研究肿瘤机制的经典案例,作者通过组蛋白ChIP seq鉴定间变性大细胞淋巴瘤anaplastic large cell lymphoma,ALCL)中特有的超级增强子,筛选到肿瘤生长关键调控因子BATF3,并进一步通过ChIP seq和RNA seq联用筛选BATF3的直接靶标基因,最终解析了BATF3/IL-2R在ALCL肿瘤中的作用机制。

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研究背景和待解决的科学问题

系统性间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)是一种侵袭性CD30阳性恶性的T细胞淋巴瘤,根据有无间变性淋巴瘤激酶(ALK)融合可分为ALK阳性(ALK+)ALK阴性(ALK−)ALCL, 尤其会危害儿童和年轻成年人的健康

除了常规的化疗方案外,针对肿瘤特定靶点的精准靶向药物治疗策略是目前主要的治疗手段,如CD30抗体偶联药物(antibody-drug conjugate,ADC),但一些特定系统性ALCL亚型的预后并不令人满意,寻找新的治疗靶点及广泛适用的癌症疗法非常值得研究。

超级增强子在肿瘤增殖中具备超强的转录调控功能,肿瘤中特异的SE往往驱动肿瘤细胞关键致癌基因的表达。超级增强子的鉴定主要手段是通过ChIP seq检测转录活性标记分子在全基因组的富集,如组蛋白修饰标记的H3K27ac、H3K4me1,染色质修饰P300等。

本文想要解决的科学问题就是通过ChIP seq超级增强子鉴定筛选调控ALCL肿瘤生长的关键因子,进一步解析寻找新的ALCL候选治疗

 

 

研究思路和结果

一、ALCL中特异超级增强子(SE)分析获得候选ALCL关键调控因子。

作者首先采用ChIP seq检测8种ALCL细胞系(5 ALK+, 3 ALK−)全基因组水平上H3K27ac修饰分布水平,通过超级增强子分析软件ROSE筛选SE。

1. 在Karpas-299 和Mac-1 中分别鉴定到538和722个超级增强子(下图a);

2. 两者共有的SE关联基因通过韦恩图进行展示,其中包含 BATF3IL-2RB以及已知的ALCLH肿瘤相关基因,如CD30(下图c)

3. IGV可视化图展示了BATF3关联的SE区间分布,伴随很强的H3K27ac信号分布(下图b);

 

4. BATF3、IL-2RA和/或IL-2RB基因关联的SEs特异存在于ALCL细胞系,在正常T细胞系未观察到(见下图)。

 

5. 此外,作者在原代ALCL组织样品中也发现了类似的的SEs模式(下图d)。

 

ALCL组织及细胞系特异的超级增强子关联基因中均包含BATF3IL-2R基因,暗示BATF3和IL-2R可能与ALCL肿瘤相关

 

二、BATF3IL-2R亚基在ALCL中特异高表达维持细胞增殖活性。

    为了进一步确认BATF3和IL-2R在ALCL中的功能,作者分析了ALCL病例样本中BATF3及IL-2R亚基的表达情况,并通过生理实验检测BATF3对ALCL细胞增殖的影响。    

1. 免疫化学染色(IHC)定量结果显示,BATF3蛋白IL-2R蛋白亚基在ALCL组织中特异高表达(见下图)。

 

2. 蛋白(IHC)及转录水平(RNA seq)相关性分析表明BATF3和IL-2R亚基在ALCL病例组织中的表达呈正相关。

 

3.  BATF3敲除及回补实验表明BATF3正调控ALCL细胞的增殖

 

上述结果表明BATF3在ALCL中高表达能够促进ALCL的增殖;BATF3作为转录因子与IL-2R表达呈正相关,暗示BATF3和IL-2R在ALCL活性维持中存在关联性

 

三、BATF3蛋白直接靶标并调控IL-2RCD30基因表达。

由于BATF3与IL-2R在ALCL表达存在相关性,转录因子BATF3可能调控IL-2R亚基基因的表达。为了验证这一猜想,作者通过RNA seqChIP seq联用,筛选BATF3蛋白的直接靶标基因。

1. RNA seq检测发现BATF3敲除会导致IL-2R亚基基因及CD30(ALCL标志基因)显著下调(下图左),且下调基因通路富集到IL-2(IL-2R识别上游信号因子)介导的信号通路(下图右)。

 

2. qPCR验证了ALCL细胞系中BATF3对IL-2R亚基基因的转录调控

 

3. ChIP seq可视化结果显示BATF3蛋白和H3K27ac(SE组蛋白标志性修饰)在靶标基因IL-2RAIL-2RBCD30上的共分布。

 

4. ChIP-qPCR验证了BATF3在IL-2RAIL-2RBCD30基因启动子或超级增强子区域有富集。

 

5. 凝胶迁移(EMSA)实验证明了BATF3蛋白与IL-2RAIL-2RB相互作用

 

上述结果表明,BATF3直接结合并促进靶标基因IL-2RA/BCD30ALCL中的表达

 

四、IL2/15-IL-2R促进ALCL生长并激活STAT1/5和ERK信号通路

既然BATF3在ALCL中促进IL-2R亚基的表达,那么IL-2R是否与BATF3对ALCL的生长调控相关?为了解答这个问题,作者从IL-2R的上游激活信号因子IL2/IL15入手,验证其对ALCL的调控作用。

IL2和IL15的识别受体共用IL-2Rα和IL-2Rβ两个亚基 ,其中IL-2R的三个亚基IL-2Rα,IL-2Rβ和IL-2Rγ组成IL-2的受体;IL15受体则由IL-2Rα,IL-2Rβ和IL15γ组成。

1. 重组IL2(rhIL-2)处理可以促进大部分ALCL细胞系的增殖(下图a),且这一过程依赖于BATF3(下图b)。

 

2. Neo-2/15(IL2类似物)处理对ALCL生长促进效果与rhIL-2效果一致。

 

3. IL2处理能特异性增强ALCL细胞中STAT1/5(ALCL标志性基因)ERK1/2的磷酸化水平(下图c)并影响细胞增殖(下图d),而特异性识别IL-2Rα并阻碍其与IL-2结合的抗体basiliximab可以削弱IL-2的作用(下图e)。

 

4. IL-15处理ALCL细胞系表现出与IL-2一致的生长促进效应。

上述结果表明,IL2/15-IL-2R促进ALCL细胞生长及ALCL相关信号的激活,故IL-2RA可能成为ALCL治疗的候选靶标

五、IL-2RA的表达与ALCL病人生存相关,是潜在的治疗靶点。

鉴于IL-2/IL-2R在ALCL中的作用,作者进一步探究了IL-2Rα作为ALCL治疗靶点的可能性。

1. ALCL肿瘤中高表达IL-2RA的患者生存率显著降低。

 

2. 作者比较IL-2Rα抗体偶联靶向药物ADCT-301与非IL-2Rα靶向ADC(B12-SG3249)对ALCL的处理效果,结果发现ADCT-301诱导了ALCL细胞系的死亡。

 

3. ADCT-301可以抑制ALCL机体(动物肿瘤模型)中肿瘤的生长。

上述结果表明IL-2Rα可以作为ALCL肿瘤治疗的候选靶点

 

 

 

总结

本文通过ChIP seq超级增强子鉴定,筛选到ALCL肿瘤关键的调控因子BATF3/IL-2R,进一步采用ChIP seq及RNA seq联用解析了BATF3转录激活IL-2R基因在ALCL中的表达机制。作者运用生理及生化实验证据描绘了IL2/IL-2R信号通路在ALCL中促癌作用模型(见下图)。值得强调的是,本研究表明IL-2Rα能作为治疗ALCL的一种潜在新靶点。

文章利用ChIP seq筛选关键调控因子和研究转录调控的思路非常值得学习借鉴。ChIP seq—蛋白核酸互作研究利器,认准康测科技!

 

文献链接:https://www.nature.com/articles/s41467-021-25379-9