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康测科技ATAC-seq助力中国医学科学院肿瘤医院刘芝华副院长课题组发表Cancer research
2022-07-15 下载

 

研究背景

鳞状细胞癌(SCC)是一种起源于各器官鳞状上皮细胞的恶性肿瘤。包括铂类药物在内的细胞毒性化疗方案已被广泛用于治疗SCC,但由于耐药性和复发情况的发生,SCC患者通常预后较差,目前对于鳞状细胞癌耐药性的潜在机制仍不清楚。

癌细胞中的代谢重编程已被公认为癌症发生和进展过程中的一个基本过程。其中磷脂酸(PA)可以激活YAP信号通路,通过TEAD介导的转录调控并参与多种癌症的化疗抗性,但是在SCC中这个机制还未被阐明。为了研究SCC的化学耐药机制,寻找新的治疗靶点,作者开展了如下实验。

 

研究结果

  1. D-AS2SCC化疗抗性中被鉴定为关键的脂质相关lncRNA

为了确定SCC化学抗性的机制,作者首先模拟临床治疗的情景,用高剂量DDP处理SCC细胞,并构建了两个DDP抗性细胞模型:YES2/DDPKYSE450/DDP (Fig. 1A)

接着作者对YES2/DDPKYSE450/DDPYES2KYSE450亲本细胞进行了全转录组测序,并分析了化疗抗性和亲本细胞系中差异表达的mRNAncRNA (Fig. 1A)。与亲本细胞相比,在YES2/DDPKYSE450/DDP细胞中分别鉴定出352/153311/173个显著上调/下调的ncRNA,其中有26/12个显著上调/下调的ncRNAs在两个化疗抗性细胞系中表现一致(Fig. 1B and C)

对两个化学抗性细胞系中差异表达一致的mRNA进行KEGG富集分析,结果显示这些mRNA在几种癌症调节通路中富集(Fig. 1D)。有趣的是,差异表达的mRNA也富集在一些代谢途径中,其中PLD信号通路是富集最显著的途径(Fig. 1D)。此外,作者还发现在38个差异表达一致的ncRNA中有7 个(5 个上调和 2 个下调;Fig. 1C 中的绿色箭头所示)在PLD信号通路中富集。

 

 

 

随后,作者鉴定了在化疗抗性和代谢重编程中起重要作用的ncRNA。作者评估了5个显著上调ncRNA的表达水平,发现只有 NR_119377.1(即 D-AS2)表达水平较高。同时RT-qPCR结果也验证了,与亲代细胞相比,D-AS2在化疗抗性表型细胞中表达升高(Fig. 1E)

   为了验证D-AS2的上调是有助于化疗抗性的重要事件,作者用DDP短时间(61224小时)处理YES2NCI-H1703细胞,并检测D-AS2的表达。结果显示DDP处理后,D-AS2表达以时间依赖性方式升高(Fig. 1F)。这些结果共同说明D-AS2的表达水平影响SCC细胞对化疗的抗药性。

  1. D-AS2功能研究初步揭示SCC化疗抗性的特性

随后,作者对D-AS2SCC化学抗性中的作用进行功能研究作者首先选择沉默D-AS2基因,结果显示两种细胞化疗抗性细胞系对DDP治疗敏感(Fig. 2A)

D-AS2的敲低同样降低了亲本NCI-H1703KYSE30细胞对DDP耐药性(Fig. 2B)。而将SCC细胞过表达D-AS2后则显著增加了它们对DDP的耐药性。

为了进一步阐明D-AS2在体内的功能,作者将对照或D-AS2过表达的UM1细胞皮下移植到裸鼠体内并在一周后给予生理盐水或DDP处理。与体外实验结果一致,D-AS2过表达UM1细胞显示出较低的生长速率,并对DDP抗药性增加(Fig. 2C),而在亲本KYSE30细胞中敲低D-AS2则促进了异种移植物的生长,并对DDP处理敏感(Fig. 2D)

为了确定在SCC化疗期间干扰D-AS2的影响,作者从舌头和食管SCC组织样本中建立了三个PDX模型,并在体内施用多种ASO序列用以模拟临床治疗情景。在所有模型中,体内施用靶向D-AS2ASO序列使得SCCDDP敏感性显著提升(Fig. 2E-G)

细胞的增殖速率主要取决于细胞周期的进程,因此,作者随后探索了D-AS2SCC细胞周期的影响。结果显示,D-AS2过表达细胞相比对照细胞在G0/G1期积累更多(Fig. 2H),另一方面,D-AS2敲低导致KYSE30NCI-H1703细胞中G0/G1期细胞群体减少,而G2/M期细胞群体增加(Fig. 2I)。这些结果说明D-AS2表达水平升高可以提升SCC对化疗的抗药性,并且可以影响SCC细胞增殖速率。

 

3.FAM3D充当脂质相关靶标,介导D-AS2的功能

为了确定D-AS2下游事件,作者将对照和过表达D-AS2 KYSE450细胞进行了RNA-seq。意外的是,与化疗抗性细胞中上调基因多于下调基因的发现相反,D-AS2过表达导致SCC细胞中D-AS2靶标基因转录水平收到抑制(Fig. 3A)

随后,作者将D-AS2过表达细胞、YES2/DDPKYSE450/DDP化疗抗性细胞中差异表达上调或下调的基因分别取交集(Fig. 3B and C),结果显示有六个基因在三个比较组中一致下调(Fig. 3B)。在这六个下调基因中,作者最关注FAM3D,因为其编码的细胞外分泌蛋白可作为细胞膜受体的配体激活细胞内的信号转导,如G蛋白偶联受体(GPCRs)。

为了确定FAM3D是否对D-AS2在细胞周期中的功能和化疗抗性至关重要,作者进行了细胞周期测定,结果显示:FAM3D过表达表达消除了D-AS2KYSE450细胞在G0/G1停滞的影响(Fig. 3D)

而使用两个独立的shRNA敲低FAM3D则挽救了D-AS2缺失对细胞周期进程的影响(Fig. 3E)

细胞活力测定表明,FAM3D过表达挽救了D-AS2作用下SCC细胞对DDP的化学敏感性的影响(Fig. 3H and I)。这些结果表明FAM3DD-AS2的直接下游靶标,并有助于D-AS2对细胞周期进展和对细胞毒性药物的化疗抗性的影响。

 

  1. D-AS2影响FAM3DH3K27ac修饰附近的染色质可及性

为了探索D-AS2调控FAM3D表达水平的机制,作者测定了D-AS2SCC细胞中的亚细胞分布。FISH结果表明,D-AS2主要定位于细胞核中(Fig. 4A)。将核与细胞质分离后进行RT-qPCR验证,结果同样证实了D-AS2在核中的优势定位。这些结果表明,D-AS2可能通过直接影响转录调控事件而起作用。

接着作者进行了RNA pull downMS实验,结果表明一些组蛋白与D-AS2有关。然而在三次独立的MS实验中均未检测到一致的组蛋白亚型。为了验证MS结果,作者使用组蛋白H1.3H1.5和核心组蛋白H2AH2BH3H4的抗体进行了RIP实验。结果表明,在KYSE30NCI-H1703细胞中检测到D-AS2与所有连接和核心组蛋白均有相互作用(Fig. 4B)

尽管组蛋白和D-AS2之间存在相互作用,但在D-AS2敲低或过表达后,组蛋白修饰水平却没有变化。因此,作者推测D-AS2可能通过更上游阶段,即通过调节染色质结构变化来影响基因转录水平。为了证实这一假设,作者在我司进行了ATAC-seq,结果显示所有基因的TSS区域周围染色质可及性D-AS2敲低后没有发生显著变化。接着作者比较敲低D-AS2组与对照组中peaks总数,结果显示敲低D-AS2导致2447个基因染色质可及性的丢失和1753个基因染色质可及性的增加,这表明D-AS2对基因表达水平有较大影响(Fig. 4D)

随后,作者分析两组共有peak20876个基因(Fig. 4D)。作者将所有基因的长度设置为3 kbTSS周围的-2 kb+ 1 kb),并比较每个基因在这3kb区域内的peak数量,RNA-seq数据一致D-AS2敲低细胞中上调基因比下调基因多(Fig. 4E)

此外,作者着重分析了FAM3D基因座ATAC-seq信号。在D-AS2敲低细胞中,FAM3D的增强子区域检测到一个单独的peak,之前有文献报道区域伴随H3K27ac的修饰(Fig. 4F),暗示FAM3D可能通过H3K27ac修饰水平上升并增加增强子染色质可及性来激活相关基因的表达

为了证明这一假设作者进行H3K27acCUT&RUN结果发现D-AS2过表达降低了KYSE450UM1细胞中FAM3D增强子区域中H3K27ac修饰水平(Fig. 4G and H)

另一方面,NCI-H1703细胞中D-AS2敲低后增加了FAM3D增强子区域中H3K27ac修饰水平(Fig. 4I)。这些结果表明,D-AS2通过减少FAM3D增强子区域中的H3K27ac修饰水平来抑制FAM3D基因的表达。

 

  1. D-AS2 通过 FAM3D 介导的 FPR1 FPR2 信号传导增强 PLD 活性

作者通过测定不同处理细胞中的PLD活性和PA产量,发现D-AS2的过表达显著提高了PLD活性和PA的产生,而FAM3D的外源性表达则阻断了D-AS2PLD活性和PA产生的增强作用(Fig. 5A and B)D-AS2敲低后导致的PLD活性和PA产量降低也被FAM3D敲低后所逆转(Fig. 5A and B)。这说明PLD被激活,并催化PA产生,而PA则有助于YAP信号通路的激活。

  1. D-AS2促进PLD/PA介导的YAP信号通路激活

Hippo-YAP是一种高度保守的信号通路,有文献报道PA可以调节YAP信号过程因此作者检测了YAP信号通路中分子的磷酸化情况;结果显示D-AS2过表达的KYSE450细胞中抑制了S127处的YAP磷酸化,并降低了S909处的LATS1磷酸化,并且促YAP下游基因CTGFCYR61的转录。另一方面,敲低D-AS2KYSE30细胞中YAPLATS1的磷酸化水平增加这些结果表明D-AS2Hippo途径调控中具有广泛的作用。

为了进一步确定D-AS2介导的YAP激活是否需要PLD的参与作者使用PLD抑制剂FIPICAY10594处理对照和过表达D-AS2KYSE450UM1细胞。结果发现,PLD抑制剂处理导致YAPLATS1磷酸化水平升高,完全消除了D-AS2YAP的活化作用(Fig. 6A)

与这些发现一致,PLD抑制剂处理完全抑制D-AS2YAP靶标的转录激活(Fig. 6B)

基于活化的LATS1/2YAP S127处磷酸化后则被隔离在细胞质中,未磷酸化的YAP可以移位到细胞核中从而激活基因转录的报道,接着作者对KYSE450细胞中YAP进行亚细胞定位,结果发现D-AS2可以显著增加YAP入核比例,而用FIPICAY10594处理则消除了这种结果(Fig. 6C and D)

PA可以通过以下三种主要代谢途径产生PLD催化PC水解生成PALPAAT催化LPA转化为PADGK介导的DAG磷酸化产生PA。为了进一步确定D-AS2介导的YAP激活是否仅限于PLD / PA途径,作者分别用CI976R59-022LPAATDGK的特异性抑制剂)处理对照和D-AS2过表达的KYSE450UM1细胞。有趣的是,CI976LPAAT的抑制或R59-022DGK的抑制未能挽救YAPLATS1被磷酸化。最后,对化疗期表现出敏感性或抗性的SCC样品进行RT-qPCR,结果表明,与敏感性样品相比,化学抗性样品中D-AS2CTGFCYR61表达量均显著上调,而FAM3D表达量则显著下调(Fig. 6I)。这些结果支持D-AS2YAP信号和化学抗性的可靶向调节剂。

 

 

研究结论

本研究对两组化学抗性和亲本SCC细胞系进行了全转录组测序,并将DLGAP1反义 RNA 2 (D-AS2) 鉴定为诱导SCC化学抗性的关键脂质相关 lncRNA。在机理上,D-AS2阻断了H3K27acFAM3D增强子区域之间的关联,从而降低了FAM3D mRNA转录水平和细胞外蛋白分泌。由于细胞外FAM3D蛋白分泌物减少,PLD被激活,并催化PA产生,而PA则有助于YAP入核并启动下游基因的转录,YAP信号通路整体上调,从而赋予SCC对化疗的抗性。

 

参考文献

Yabing Nan, Qingyu Luo, Zhihua Liu, et al. DLGAP1-AS2-Mediated Phosphatidic Acid Synthesis Activates YAP Signaling and Confers Chemoresistance in Squamous Cell Carcinoma[J]. Cancer Research, 2022