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转录因子和组蛋白修饰酶手牵手，癌症转移快快有！
2022-12-30

 

 

引言

 

康测科技金牌ChIP-seq想必无需过多介绍，以严格的质控体系（全程WB质检），领先的技术（最优的IP体系），全物种覆盖和自动化IP工作站的优势领跑行业。这次带来的文献是FOX家族的转录因子FOXQ1，并和组蛋白H3K4甲基转移酶复合物（KMT2/MLL）挂钩，同时进行FOXQ1、MLL核心亚基RbBP5和H3K4me3的ChIP-seq，结论是FOXQ1-RbBP5结合可以提升共同靶标基因启动子区H3K4me3修饰水平和激活EMT相关基因转录，那么让我们首先从一些基础背景了解这篇文章。

 

研究背景

 

上皮细胞间充质转化（EMT）是器官发育和组织修复中的基本过程。EMT的异常激活是癌症发展的关键步骤，可以促进癌细胞转移和耐药性产生。EMT调控的顶峰是一组核心EMT转录因子（TFs）驱动细胞的可塑性。

FOXQ1是Forkhead家族转录因子，在器官发育和毛囊分化过程扮演规范调控作用，但是癌细胞FOXQ1的异常表达可以触发EMT过程导致癌细胞转移能力和耐药性增强。在乳腺癌中，FOXQ1与TNBC（三阴性亚型）的侵袭性有关。但是FOXQ1如何调控基因表达还处于未知状态。已有的研究报道FOXQ1在转TGF-β和典型Wnt信号通路的下游过程上调表达。一些靶向FOXQ1 mRNA的miRNA可以抑制其表达并减少EMT事件和转移。在体内干扰FOXQ1的表达可以减少癌细胞转移事件、使其获得干性和增强化疗敏感性。FOXQ1是癌症治疗的靶点。

KMT2/MLL是组蛋白H3K4甲基化复合物（HMT），其包含4个核心亚基（WDR5/ASH2L/

RbBP5/DPY30），与其它HMT不同，KMT2/MLL内在催化活性很低，需要4个核心亚基加入来最大化增加催化活性。H3K4me1修饰主要分布在活性增强子元件中；H3K4me2修饰主要分布在转录活跃基因的gene body区；而H3K4me3修饰主要分布在TSS附近的启动子区并激活转录。KMT2/MLL和核心亚基催化H3K4甲基化和激活相关基因转录在整个细胞发育过程和癌症发展中是主要调控因素。那我们来看看这篇文章是如何将FOXQ1关联到HMT复合物（KMT2/MLL+4核心亚基）上的吧！

 

研究结果

 

  1. FOXQ1与KMT2/MLL核心复合物发生互作

作者首先通过TAP-MS鉴定与FOXQ1发生互作的蛋白，共鉴定到98种FOXQ1复合蛋白，包括KMT2/MLL核心亚基RbBP5、WDR5和ASH2L蛋白(Fig. 1a)。同时，作者通过Co-IP在过表达FOXQ1的HMLE细胞（TNBC模型）验证了FOXQ1可以结合RbBP5、WDR5和ASH2L蛋白(Fig. 1b)。

   接着，作者开展成对结合检测，用以鉴定直接与FOXQ1结合的MLL复合物组分。结合GST pull-down和WB结果，作者发现只有纯化的RbBP5与重组GST-FOXQ1结合，这表明RbBP5负责将FOXQ1直接与MLL复合物结合(Fig. 1c)。此外，作者在多个TNBC细胞系（MDA-MB-231，SUM1315，MDA-MB-436）中进一步证实内源性FOXQ1和RbBP5的相互作用 (Fig. 1d–f)。

 

    这些结果共同说明KMT2A/MLL1与FOXQ1直接结合。

 

  1. FOXQ1和MLL核心复合物共调控具有关键EMT功能的基因靶标

为了探究FOXQ1和MLL复合物互作在调控EMT转录程序中发挥的功能，那么最得力的助手便是ChIP-seq！作者在HMLE细胞中分别对FOXQ1、RbBP5和H3K4me3进行了ChIP-seq。FOX家族的TF有几种为先驱转录因子（Pioneer TF），主要结合远端增强子区域（根据康测项目经验，FOXA2在启动子区Peak分布占比较少，基因间区占比较高），而FOXQ1的ChIP-seq结果显示Peak主要分布在近端启动子区（距离TSS上游<10kb）和远端基因间区。RbBP5的Peak也分布在近端启动子区和远端基因间区，如下图a。

FOXQ1与RbBP5有4294个（34%）Peak重叠，并且FOXQ1有2073个（15%）Peak具有H3K4me3修饰（根据康测经验，虽然组蛋白通常用broad peak，这里组蛋白用narrow peak模式call peak是为了找到更准确的重叠区域）。

此外，FOXQ1和RbBP5结合模式与具有高水平H3K4me3修饰的转录起始位点（TSS）相关，证明MLL在FOXQ1靶基因激活中的作用，如下图c（康测科技也有同款图片）。

最后，FOXQ1和RbBP5重叠区域的motif分析也存在Forkhead家族的motif，如下图左。到这里，ChIP-seq几个关键结果作者已经一一展示，除了FOXQ1、RbBP5和H3K4me3 peak在TSS上下游分布图（康测科技H3K4me3 TSS分布图，如下图右）。

  

同时作者对HMLE细胞和对照细胞进行了RNA-seq，结果显示在2499个上调表达的基因中，FOXQ1可以结合791个(~32%)基因启动子区域(Fig. 2d)，而且92%的FOXQ1结合启动子区同时也被RbBP5占据，73%启动子存在H3K4me3修饰 (Fig. 2e)。

此外，作者发现FOXQ1-RbBP5共同调控转录激活的基因在EMT程序的关键通路中显著富集，包括Wnt、PDGF、TGF-β和钙粘蛋白信号通路(PANTHER) (Fig. 2f)。

最后，四个EMT转录因子(FOXC2，TWIST1，ZEB1，SIX2)被鉴定为FOXQ1-RbBP5的下游靶标(Fig. 2g)。ChIP-qPCR结果也证实了FOXQ1和RbBP5在EMT相关基因启动子中的共定位。

 

  1. FOXQ1的EMT靶标基因转录激活需要MLL核心复合物的参与

为了研究FOXQ1如何在调控EMT进程中将MLL复合物招募到靶标基因启动子区域，作者将同时存在FOXQ1、RbBP5和H3K4me3信号的一组EMT基因集作为阳性对照(Fig. 3a)，两个RbBP5不结合的FOXQ1靶基因(CTSB、IL17RA)作为阴性对照，并敲低RbBP5，结果发现导致FOXQ1和RbBP5同时结合在启动子区的靶标基因的表达降低，而FOXQ1和阴性对照基因(CTSB，IL17RA)的mRNA表达水平没受影响 (Fig. 3b)。

接下来为了探究FOXQ1调控转录激活是否需要招募MLL1以及H3K4甲基转移酶活性，作者在HMLE细胞中敲低MLL1或用OICR-9429处理（可以破坏WDR5与MLL间的蛋白互作，并阻止H3K4me3修饰发生）。当MLL1敲除后，FOXQ1-RbBP5共同靶标基因的表达水平降低 (Fig. 3c)；当OICR-9429处理后，FOXQ1-RbBP5共同靶标基因的表达水平呈现剂量依赖性降低(Fig. 3d)。而阴性对照CTSB和IL17RA在MLL1敲低或用OICR-9429处理后，表达均未发生显著变化。

    最后，作者在TNBC表型其他细胞系中敲除FOXQ1，结果显示FOXQ1靶基因的表达降低。而在相同细胞中敲低RbBP5，导致FOXQ1-RbBP5共同靶标的表达水平降低，但CTSB和IL17RA表达无显著变化。同样敲低MLL1或用OICR-9429处理后FOXQ1-RbBP5共同靶标基因的表达水平降低。总之这些结果表明，FOXQ1的EMT靶标基因的转录激活需要招募RbBP5和MLL1。

下一步作者检测FOXQ1和MLL复合物在选定位点的相互依赖性，ChIP-qPCR结果显示FOXQ1对靶标启动子的识别不受RbBP5敲低的影响 (Fig. 3e)，但RbBP5敲低会导致FOXQ1-RbBP5共同靶标基因启动子处H3K4me3修饰水平显著降低(Fig. 3f)，说明MLL复合物在靶标位点添加H3K4me3修饰中发挥的关键作用。当FOXQ1敲低后，EMT相关靶标基因启动子区RbBP5的结合减少、H3K4me3修饰丰度降低(Fig. 3g,h)，但RbBP5表达不受影响。因此，作者推测FOXQ1在RbBP5和MLL招募的上游过程起作用。在另一个细胞系中，作者证实FOXQ1缺失可以导致EMT靶标基因启动子区RbBP5结合减少，综上所述，FOXQ1可以将MLL复合物招募到FOXQ1靶基因启动子区作为转录辅助激活因子。

 

  1. FOXQ1蛋白Forkhead结构域的N-末端介导与RbBP5蛋白互作

为了深入研究RbBP5与FOXQ1蛋白互作区域，作者克隆了一系列FOXQ1亚结构域，并在HEK293细胞中验证。FOXQ1的中心区域包含Forkhead box DNA结合域(FHD)，而FOXQ1的氨基和羧基末端是非结构化的。作者首先检测了FOXQ1的这三个主要区域的作用(Fig. 4a)。结果发现FOXQ1 N端(1-142)和FOXQ1-FHD(105-227)片段均保留与RbBP5结合的能力，而C端(204-403)片段则没有(Fig. 4b)。

随后进一步设计发现，只有包含FOXQ1 FHD(105-142)N-末端区域才保留与RbBP5互作的能力(Fig. 4c)。再将FOXQ1 N末端区域截断,75-142区域仍然保留与RBBP5结合的能力，表明该区域是FOXQ1与MLL核心复合物结合的最低限度(Fig. 4d)。

FOX超级家族共有一个保守的FHD结构域，包含三个α-helix，三个β-sheet和两个翼区，鉴定到的RbBP5结合区（FOXQ1残基75-142）位于FOXQ1 FHD中，包含helix-1 and sheet-1 (H1-S1)，该区域在各物种间高度保守(Fig. 4e)。然而，与人FOX家族中的FHD序列相比存在差异；作者假设FOXQ1 H1-S1中的氨基酸可能作为一种进化保守机制介导与RbBP5的相互作用。作者在H1-S1 FHD区域内进行了定点突变，并将H1-S1外的残基（K112E，R164E，R168E）作为对照(Fig. 4f)，结果发现这些突变没有改变FOXQ1的核定位，当helix-1残基从非极性突变为极性(A126S、A129S、I132S)或Sheet-1中的氨基酸突变为同源残基(A136P、G137E、G138E)，FOXQ1结合RbBP5的能力降低(Fig. 4g)。残基A129S和I132S的突变导致与RbBP5的结合能力急剧下降(Fig. 4g)。总之，这些数据表明FOXQ1 FHD结构域包含RbBP5的结合域，破坏该区域会扰乱蛋白间相互作用。

  1. 破坏FOXQ1-RbBP5的蛋白互作会减弱EMT进程

为了探究破坏RbBP5招募对FOXQ1转录的影响，作者对稳定表达RbBP5结合缺陷突变体FOXQ1-I132S的HMLE细胞进行RNA-seq。PCA分析结果表明，对比过表达野生型FOXQ1的HMLE细胞（WT），HMLE-I132S细胞表达模式与对照HMLE细胞类似。相对于对照HMLE细胞，HMLE-WT和I132S突变细胞只有一小部分(~12%，350个基因)是共有差异表达基因，其中共有的差异表达上调的基因仅有164个(Fig. 5a)。

在I132S突变细胞中上调表达的基因在上皮细胞功能、DNA损伤反应和各种代谢过程中富集；而下调表达的基因则在与EMT相关的功能通路中富集，如细胞迁移、血管生成和TGF-β信号传导(Fig. 5b)，这表明I132S突变体失去了EMT相关基因转录激活的功能。

基于上述结果，作者自然推测该结果可能是由于FOXQ1不能招募MLL核心复合物到EMT靶基因启动子区所致。为了验证这一假设，作者比较I132S突变和WT细胞中FOXQ1-RbBP5共同靶标基因的表达水平。结果发现差异表达的FOXQ1-RbBP5共同靶标中，~93%(484/521)的靶标在I132S突变细胞中的表达低于WT细胞(Fig. 5c)。

与蛋白互作的结果一致，表达RbBP5结合缺陷的FOXQ1突变体(A129S或I132S)的HMLE细胞中依赖招募RbBP5而转录激活的基因的表达水平降低(Fig. 5d)，而不依赖RbBP5的FOXQ1靶基因的表达保持原有水平(Fig. 5e)。ChIP-qPCR结果表明：点突变不会破坏FOXQ1 DNA的结合(Fig. 5f)。最后，作者还用表达FOXQ1-I132S、FOXQ1-A129S或FOXQ1-WT的慢病毒感染敲低FOXQ1的细胞，以评估它们恢复FOXQ1靶基因调控的能力。结果发现，在TNBC表型细胞中表达FOXQ1-A129S和FOXQ1-I132S突变都没有将FOXQ1-RbBP5共同靶标基因的表达恢复到野生型水平。这些结果说明FOXQ1与RbBP5结合能力的丧失可以破坏FHD的反式激活能力，从而阻碍FOXQ1作为EMT转录因子的能力。

  1. FOXQ1-MLL轴对体外和体内EMT进程和肿瘤发展至关重要

在上文体外条件下已经验证FOXQ1-MLL对EMT进程的重要性，作者接下来将目光聚焦于癌细胞的表型上。过表达FOXQ1的HMLE细胞中敲低RbBP5可以导致显著的细胞形态变化，同时细胞迁移和侵袭减少(Fig. 6a，b)。

与之前结果类似，OICR-9429处理后的过表达FOXQ1 HMLE细胞中，细胞迁移和侵袭减少(Fig. 6f，g)；还导致干性特征减少，包括乳房小球形成和CD44+/CD24-群体减少(Fig. 6i，j)。

 

接着，作者比较了WT和RbBP5结合缺陷突变体(A129S或I132S) FOXQ1对EMT和干性表型的影响。WB结果表明：表达突变体FOXQ1（A129S或I132S）的HMLE细胞没有经历EMT过程，Vimentin和N-钙粘蛋白的诱导低效，E-钙粘蛋白保留(Fig. 7a)。

表达任何一个突变体FOXQ1的HMLE细胞的迁移和侵袭能力都低于WT(Fig. 7b，c)。HMLE/FOXQ1突变细胞缺乏干性特征，表现为乳房小球形成能力不足，CD44+/CD24-群体减少(Fig. 7d，e)。突变体-FOXQ1(A129S或I132S)恢复表达的MDA-MB-231/shFOXQ1细胞与WT相比，间充质标记蛋白的表达减少，而上皮标记occludin的表达保持不变(Fig. 7f)。

与WT-FOXQ1挽救的细胞相比，突变体-FOXQ1表达(A129S, I132S)的MDA-MB-231/shFOXQ1细胞的侵袭、迁移、乳房小球形成减少，上皮样形态更为突出(Fig. 7g-i)。最后，与WT-FOXQ1细胞相比，突变体-FOXQ1表达的MDA-MB-231/shFOXQ1细胞中CD44表达降低，CD24表达升高，干性特征减少(Fig. 7j)。

最后作者在体内评估了靶向FOXQ1-MLL1轴对TNBC致癌特性和肿瘤转移的影响。首先敲低MLL1的细胞迁移和侵袭显著减少 (Fig. 8a, b)，但细胞增殖没有明显下降(Fig. 8c)。

同时，与NT对照细胞相比，MLL1敲低的MDA-MB-231细胞中 CD44+/CD24−群体减少(Fig. 8d)。

随后将敲低和未敲低MLL1的MDA-MB231细胞分别植入雌性NSG小鼠的乳腺脂肪中，MDA-MB231 NT组在第15天显示中位肿瘤发病，而植入MDA-MB231 sh1和sh3的小鼠在第18天出现中位肿瘤(Fig. 8e)。此外，NT组肿瘤发展从启动到终点花了31天，而两个MLL1敲低组则需要32天(Fig. 8e)。这些结果表明，MLL1敲低组和对照组相比，肿瘤的启动和发展没有显著差异。

经H&E染色，MLL1敲低肿瘤组相较非靶向对照组，瘤内细胞形态更具上皮样 (Fig. 8f, top panels)，间充质标志物纤连蛋白表达水平更低 (Fig. 8f)。与体外结果一致，通过Ki-67染色确定MLL1敲低后肿瘤的增殖没有明显变化 (Fig. 8f)。最后，取肺，切片，H&E染色，镜检，作者发现：与植入NT对照细胞的小鼠相比，植入MLL1敲低细胞的小鼠肺部转移灶显著减少(Fig. 8g，h)。

 

总结

 

这篇文献主要完成的创新性工作：a. 首次鉴定FOXQ1可以和MLL核心亚基RbBP5结合；b. 癌细胞EMT进程激活需要FOXQ1招募MLL复合物。该文献运用大量验证技术，包括Co-IP、ChIP-qPCR、敲低/过表达、突变/截断、免疫染色等等，得到非常切实的结论；其中ChIP-seq在文献中的关键贡献是找到FOXQ1-RbBP5共同调控的EMT靶标基因，让我们总结下作者的工作：

  1. 通过TAP-MS鉴定到MLL核心复合物（RbBP5，WDR5和ASH2L）与FOXQ1发生互作，并通过Co-IP验证；
  2. 进一步通过GST pull-down和WB实验，发现FOXQ1与MLL复合物中的RbBP5直接结合，并在多个TNBC表型细胞系中得到验证；
  3. ChIP-seq和RNA-seq鉴定FOXQ1和MLL核心复合物共同调控的靶标基因；
  4. 敲低RbBP5、敲低MLL1和OICR-9429处理证明EMT基因转录激活需要FOXQ1招募MLL，并结合在启动子区；
  5. 克隆亚结构域序列和截断，对FOXQ1与RbBP5结合区域进行定位：FHD结构域N端的α-Helix1和β-Sheet1为结合活性区域；
  6. RbBP5结合缺陷突变体FOXQ1-I132S的RNA-seq结果表明破坏FOXQ1-RbBP5的蛋白互作会减弱EMT进程；
  7. 体外体内功能实验表明：FOXQ1-MLL轴对EMT和体内肿瘤进展至关重要，可作为治疗潜在靶点。

 

参考文献

Allison V. Mitchell, Ling Wu, Guojun Wu, et al. FOXQ1 recruits the MLL complex to activate transcription of EMT and promote breast cancer metastasis[J]. Nature Communications, 2022

DOI：10.1038/s41467-022-34239-z

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