引言

本期带来的同样是康测科技客户ChIP-seq文献，不同的是这次客户已经有了明确的靶标基因，但是调控靶标基因的转录因子还是未知的，因此通过ChIP--seq可以提供转录因子与靶基因结合的直接证据和位置。该文献同样提供已知靶基因如何寻找调控其表达的转录因子的实验方法和思路，让我们一起来看看吧。

研究背景

肺癌（LC）是一种侵袭性极强的恶性肿瘤，可分为非小细胞肺癌（NSCLC）和小细胞肺癌。其中，肺腺癌(LUAD)是非小细胞肺癌最常见的病理亚型。由于LUAD早期发现困难、转移率高、对放化疗耐药以及缺乏系统治疗，患者的5年生存率较低。

氯离子通道3蛋白(CLCN3)主要调节细胞间离子的稳态和细胞区室的酸化，被证明在胶质瘤、卵巢癌和胃腺癌细胞的增殖、迁移和耐药中起重要作用。因此，CLCN3可能与部分肿瘤的发生发展相关。

hnRNP是一个RNA结合蛋白家族，参与前体mRNA的加工、成熟mRNA的转运以及mRNA的转录和翻译。hnRNP与细胞增殖、细胞侵袭、氧化应激和代谢重编程相关。家族成员HNRNPK调节多种细胞功能，包括DNA/RNA结合、转录和核质穿梭。在部分类型的恶性肿瘤中，HNRNPK被认为是一种致癌基因，并预示着较低的存活率。

肿瘤微环境(TME)包含肿瘤、基质和免疫细胞。构成基质的大多数细胞被称为癌症相关成纤维细胞（CAF），已知CAF可驱动TME中的癌症进展。为了深入了解LUAD发生发展的分子机制，寻找新的分子标记，提高LUAD诊断和治疗的水平，作者开展了如下研究。

研究结果

1. CLCN3表达在LUAD中上调

通过IHC和IF染色，作者首先检测30个LUAD组织和癌旁组织（ANT）中CLCN3的表达情况，结果发现CLCN3的表达水平在LUAD组织中升高，并主要定位于细胞质(Fig. 1a, 1b)。接着，作者通过WB检测了HBE细胞和人LUAD细胞系(H1299、A549和PC-9)中CLCN3的蛋白表达水平，结果表明：与正常细胞相比，LUAD细胞中CLCN3的蛋白表达水平升高(Fig. 1c, 1d)。此外，CLCN3的RNA水平与其在组织和细胞系中的蛋白表达水平相当(Fig. 1e)。综上所述，CLCN3在LUAD中表达上调。

   随后，作者敲低CLCN3并进行RNA-seq，结果共鉴定出3006个差异表达基因。其中，上调基因1681个，下调基因1325个。KEGG富集分析表明，差异表达基因主要在一些信号转导通路富集。而GO富集分析则显示：差异表达基因主要在运动和生长方向显著富集(Fig. 1g)。

基于上述发现，作者进一步研究了CLCN3在肿瘤体外增殖和迁移中的作用。通过克隆

形成和MTS实验，作者发现：敲低CLCN3减少了LUAD细胞克隆形成的数量(Fig. 1h)，并在24小时内显著抑制细胞增殖。同时，Transwell和scratch wound-healing实验也证实：与对照细胞相比，敲低CLCN3显著减少了细胞侵袭和迁移(Fig. 1i)。综上所述，CLCN3促进了肿瘤的增殖和迁移，在人LUAD中发挥了致癌作用。

2. CLCN3受HNRNPK调控

为了探究LUAD中CLCN3表达的转录调控机制，作者将对应CLCN3启动子区域（-248 到+226）的5’端有生物素标记的DNA探针与核蛋白提取物共孵育，以筛选可能与CLCN3启动子结合的转录因子。经过SDS-PAGE分离和银染，作者观察到一个差异表达的蛋白质（75 kDa左右，红框标记），该蛋白在LUAD细胞中富集（Fig. 2a, left）。接着，作者切胶回收并进行MS检测。作为可能与CLCN3启动子结合的蛋白质，转录因子HNRNPK具有最佳的肽谱序列，即ALRTDYNASVSVPDSSGPER（Fig. 2a, right）。此外，作者借助特异性DNA探针（CLCN3 Probe）和非特异性DNA探针(NSP Probe)进一步验证了HNRNPK与CLCN3启动子的结合（Fig. 2b）。

接着，作者在H1299细胞中用针对HNRNPK的特异性抗体进行Co-IP，发现IP相对于IgG，HNRNPK蛋白条带显著富集（Fig. 2c）。随后作者在康测科技进行HNRNPK ChIP-seq，作者展示CLCN3启动子区富集情和整体TSS上下游富集情况（Fig. 2d）。最后，敲低HNRNPK后，qPCR结果显示CLCN3转录受到抑制，这说明CLCN3的转录水平受HNRNPK调控（Fig. 2e）。

    此外，作者构建了一系列截短的CLCN3启动子双荧光报告质粒。双荧光素酶报告实验表明，在H1299细胞中沉默HNRNPK会削弱报告质粒的启动子活性，而在ChIP-seq数据中，此处富集motif ‘GCGAGG/CTAATG’（Fig. 2f）。GO富集分析显示HNRNPK在细胞增殖和迁移的正向调控过程方向中富集，这说明HNRNPK具有正向调节细胞增殖和迁移的生物学功能。此外，信号转导、蛋白质磷酸化、凋亡过程、细胞周期和转录都与HNRNPK有关（Fig. 2g）。KEGG富集分析揭示，基因主要在细胞生长和死亡、细胞运动、转录、翻译和其他信号通路中富集（Fig. 2h）。最后，作者在转染报告质粒的HNRNPK敲低细胞中观察到荧光素酶活性显著降低（Fig. 2i）。综上所述：HNRNPK是与CLCN3启动子结合的转录因子，并且HNRNPK功能与CLCN3类似。

3. 体外敲低/过表达HNRNPK验证其生物学功能

为了进一步研究HNRNPK表达调控机制，作者构建HNRNPK敲低细胞系（H1299和A549），并用CLCN3过表达的慢病毒转染细胞进行挽救。WB结果证实：HNRNPK敲低后CLCN3的表达受到抑制，但过表达CLCN3后抑制被解除（Fig. 3a）。此外，HNRNPK敲低后，LUAD细胞的增殖也受到抑制，但这种抑制可以通过过表达CLCN3恢复（Fig. 3b,3c）。同样HNRNPK敲低后，细胞克隆减少，但过表达CLCN3后可恢复（Fig. 3d）。Transwell和scratch wound healing实验也表明，敲低HNRNPK后，细胞的侵袭和迁移受到抑制，但这种抑制可被CLCN3过表达解除（Fig. 3e）。总体而言，体外，HNRNPK沉默后，CLCN3的表达和功能受到抑制。

为了进一步探究CLCN3是否为HNRNPK的靶标，作者构建了HNRNPK过表达细胞系(PC-9)，并用敲低CLCN3的慢病毒转染细胞进行挽救。WB结果表明，HNRNPK过表达后CLCN3的表达增加，但当CLCN3敲低后，这种增加被消除。MTS实验、克隆形成实验、IncuCyte数据和细胞增殖图像结果均显示：HNRNPK过表达促进了LUAD细胞的增殖和克隆形成，而CLCN3敲低则解除了这些促进作用。此外，transwell 和scratch wound healing实验证实HNRNPK过表达后细胞侵袭和迁移增强，但当CLCN3敲低后，这些促进作用被解除。这些数据表明在体外HNRNPK表达上调后，CLCN3的表达水平和功能都得到了增强。

4. HNRNPK/CLCN3轴通过LUAD与CAF的相互作用促进LUAD发展

癌症相关成纤维细胞(CAF)是LUAD基质的主要成分。为了研究CLCN3与肿瘤微环境的关系，作者首先从新鲜的LUAD样本中分离出原代CAF和正常成纤维细胞（NF），并检测了CAF和NF中CAF标志物(α-SMA、FAP和COL1A1)的表达情况。WB和IF结果显示，CAF中α-SMA、FAP和COL1A1的表达水平高于NF，这与CAF的典型特征一致（Fig. 4a）。

接着，作者检测了LUAD细胞培养上清液中CLCN3的水平，数据表明HNRNPK敲低可以诱导细胞外CLCN3蛋白分泌减少（Fig. 4b）。此外，当CAF在LUAD细胞培养上清液(HNRNPK敲低和对照)中孵育24小时，CAF转录组中KEGG富集分析结果说明用LUAD上清液刺激后，PI3K-AKT信号通路有显著富集(Fig. 4c, 4d, 4e)。紧接着，作者将CAF与HNRNPK敲低LUAD细胞的条件培养基共培养24小时，WB结果表明，当用HNRNPK敲低细胞的上清液刺激CAF时，α-SMA，FAP，p-AKT和COL1A1的水平显著降低。在敲低CLCN3的CAF中，p-AKT、α-SMA、FAP 和 COL1A1 的水平也受到有效抑制，这表明内源性或分泌型CLCN3蛋白水平降低会通过 PI3K-AKT 信号通路抑制CAF的活化（Fig. 4f）。

由于活化受抑制，作者将与敲低HNRNPK的LUAD细胞共培养的CAF认为是抑制型CAF。ELISA分析表明，抑制型CAF的TGF-β1产量显著降低（Fig. 4g）。此外，通过提取核蛋白，作者发现抑制型CAF的上清液减弱了H1299细胞核中HNRNPK蛋白的表达，但在用TGF-β1处理6 h后衰减效果逆转（Fig. 4h）。IF染色则表明，抑制型CAF的上清液可以减弱H1299细胞核中HNRNPK的荧光强度，但添加外源TGF-β1后也发生了逆转（Fig. 4i）。抑制CAFs的上清液显著改善了LUAD细胞的克隆形成、侵袭和迁移，而加入TGF-β1后，这一现象被逆转。这些发现证实了LUAD进展与细胞间相互作用相关(Fig. 4j, 4k)。上述数据支持HNRNPK / CLCN3轴通过CAF和肿瘤细胞之间的相互作用来促进LUAD发展。

5. 体内验证HNRNPK调控CLCN3的表达水平和功能

作者利用H1299细胞构建异种移植瘤小鼠模型，裸鼠皮下注射敲低HNRNPK的细胞以及挽救模型细胞，每四天测量一次肿瘤体积，25天后，移除异种移植瘤。各组形成的肿瘤情况如Figure 5A所示 (Fig. 5a)。作者发现，HNRNPK敲低后，肿瘤重量和生长受到显著抑制，但这种抑制可以被过表达CLCN3解除(Fig. 5b，5c)。异种移植瘤中CLCN3和HNRNPK的IHC染色结果显示，当HNRNPK沉默后CLCN3的表达水平降低，过表达CLCN3可以恢复其表达水平(Fig. 5d)。

接下来作者用荧光素酶质粒转染HNRNPK敲低细胞（H1299）和挽救模型细胞，结果显示，敲低HNRNPK可以有效降低肺转移病变的平均辐射强度，过表达CLCN3可以消除这一减少(Fig. 5e)。25天后分离肺转移瘤，切片后进行H&E染色，结果表明敲低HNRNPK导致肺转移面积减少，但过表达CLCN3则会消除这种影响(Fig. 5f)。综上所述，在体内CLCN3的表达水平和功能同样受到HNRNPK的调控。

最后作者在临床角度发现CLCN3和HNRNPK表达水平上调与不良预后有关，这里不再展开。

总结

1. 通过IHC和IF发现CLCN3的表达水平在LUAD中上调；敲低CLCN3可以抑制LUAD的增殖、减少侵袭和迁移；
2. 设计探针、与核蛋白提取物共孵育、SDS-PAGE分离和银染，筛选得到差异表达蛋白，MS鉴定出转录因子HNRNPK，Co-IP验证HNRNPK与CLCN3启动子结合；
3. 进行HNRNPK的ChIP-seq，在CLCN3启动子区发现具体的结合位点；敲低HNRNPK后CLCN3的表达水平降低，说明CLCN3受HNRNPK调控；
4. 体外验证：敲低HNRNPK后CLCN3的表达受到抑制、LUAD细胞增殖受到抑制、细胞克隆减少、细胞侵袭和迁移受到抑制，但过表达CLCN3后均可解除这一现象；过表达HNRNPK，CLCN3的表达增加、LUAD细胞增殖和克隆形成受到促进、细胞侵袭和迁移增强，但敲低CLCN3后均可解除。
5. 共培养CAF和肿瘤细胞上清发现CLCN3可以影响肿瘤微环境，通过HNRNPK/CLCN3轴促进LUAD进展；
6. 通过异种移植瘤小鼠模型，在体内验证HNRNPK可以调控CLCN3的表达和功能；CLCN3表达水平升高与预后不良相关。

参考文献

Yixin Li, Yang Yang, Qian Ma, et al. HNRNPK/CLCN3 axis facilitates the progression of LUAD through CAF-tumor interaction[J]. International Journal of Biological Sciences, 2022