引言
了解细胞发育与分化过程对组织再生研究至关重要，是再生医学的主要课题。细胞发育和分化过程中各阶段调控分化相关基因的表达水平离不开染色质可及性和主转录因子结合靶标的变化，如何确定染色质可及性变化和主转录因子调控靶标的区别呢？本次带来一篇Cell report的文献，通过ATAC-seq和ChIP-seq，绘制骨骼细胞分化染色质可及性变化和主转录因子Runx2结合差异图谱，站在组学视角探讨Runx2在骨骼分化过程中的功能。
背景
Runx2在哺乳动物骨骼生长过程中起着重要作用。前期研究发现在缺乏Runx2的突变体小鼠中，成骨细胞分化在Sp7激活之前就停止了；然而表达Runx2成骨细胞前体在敲除Sp7小鼠中存在，但不能发展为成熟的成骨细胞，说明Runx2在成骨细胞发育的调控时间上早于Sp7。在软骨细胞分化程序中，Runx2在增殖的柱状软骨细胞中表达水平较低，但随着软骨细胞退出细胞周期形成肥厚软骨细胞后，Runx2表达水平明显升高。在柱状软骨细胞中过表达Runx2可以加速软骨细胞肥大，而敲除Runx2会导致正常肥厚软骨矿化不足。在Runx2缺失突变体中过表达Runx2在可以挽救软骨细胞肥大和矿化，但不能挽救相邻的骨膜骨分化过程，这表明Runx2在调节软骨和成骨发育中具有相对独立的作用。Runx2在两个完全不同骨骼分化过程中的调控景观还处于未知状态，因此作者以染色质可及性的角度研究Runx2在软骨和成骨体外分化过程中的调控网络。
1、骨骼发育中不同种类细胞染色质可及性图谱
作者使用转基因报告细胞系Col2a1-ECFP（C2-Cho）、Col10a1-mCherry（C10-Cho）、Sp7-EGFP并检测Runx2的表达水平，结果显示Runx2在Col2a1-ECFP阳性柱状软骨细胞（C2-Cho）中表达水平较低，在Col10a1-mCherry阳性肥厚软骨细胞（C10-Cho）中表达水平升高；同时Runx2在Sp7-EGFP阳性成骨细胞前体和成骨细胞（S7-Ob）中的表达水平也很高。研究染色质可及性，离不开ATAC-seq，通过ATAC-seq和RNA-seq和PCA分析作者揭示小鼠不同骨细胞中的染色质可及性和表达模式（图1A）。
Col10a1和Col1a1分别编码肥厚软骨细胞和成骨细胞分泌的关键胶原基质蛋白。C10-Cho细胞中的Col10a1和S7-Ob细胞中的Col1a1基因座和上游区域检测到细胞种类特异性的染色质可及性，同时转录水平与其一致；在C2-Cho和C10-Cho软骨细胞中观察到Col2a1基因座（编码由非肥厚性软骨细胞分泌的胶原蛋白）染色质可及性，两者可及性区域位置不同(图1B)，同样其转录水平与其一致。这些结果可以说明早期柱状软骨细胞和晚期软骨细胞之间的调控差异，后者将启动肥厚性软骨细胞发育过程。
下一步作者比较三种细胞染色质可及性的差异，即Diff peak分析。通过将peak分开展示（TSS、远端）以及计算peak相关性，可以发现C2-Cho和C10-Cho相关性更高，因为他们属于同一细胞谱系。
进一步成对分析远端peak的差异可以发现某些细胞独有的染色质可及性区域以及共享的染色质可及性区域（下图D），对这些区域关联的基因分别进行GO分析，展示的Term分别与各自细胞的功能有关（下图E）。最后通过motif扫描调控这些区域可及性的主转录因子，发现S7-Ob独有的可及性区域富集Runx2的motif。
第一部分作者主要描绘了骨骼分化的染色质可及性景观，为下面研究打下基础。
2、成骨细胞和软骨细胞中Runx2结合靶标图谱
研究转录因子靶标，离不开ChIP-seq，为了确定Runx2与染色质可及性区域的关系，，进一步为了比较Runx2在成骨细胞和软骨细胞中的结合区域差异，对新生小鼠的颅骨成骨细胞和肋骨软骨细胞进行Runx2的ChIP-seq，首先展示peak数量，而且peak在基因功能区分布也较为相似(图2H)。相比TSS区域peak，远端peak与成骨细胞或软骨细胞发育相关基因的关联性更高(图2I)。
motif 分析显示TSS和远端peak中高度富集Runx家族的motif(图2J)，其中Runx motif (AACCACA)核心序列出现频率很高。Runx2对motif的识别和结合可能是Runx2与DNA结合的主要模式，与不同骨骼细胞类型中离TSS的距离无关。
接下来，为了直接比较软骨细胞和成骨细胞中的Runx2结合差异，对成骨细胞和软骨细胞peak进行了相关性分析，发现Runx2结合特征与细胞类型和染色质可及性相关(下图A)。远端Runx2结合区域在两种细胞类型之间有明显差别，而TSS区域附近结合特征没有细胞类型的差别。
因此作者重点关注ChIP-seq远端peak以及和ATAC-seq远端peak的关联，结果显示Runx2结合区域与Col10阳性软骨细胞中更高的染色质可及性相关，同时也与Sp7阳性成骨细胞中的染色质可及性高度相关（下图B-D）。这些数据表明Runx2结合特征与细胞类型不同的染色质可及性有关。
最后作者讨论了Runx2在不开放染色质区域中的结合情况，发现这些区域还能找到CTCF和REST的motif，说明Runx2可能结合有限数量的封闭染色质区域来调控骨骼发育，可能还与其他染色质调节因子（包括CTCF和REST）相互作用间接结合DNA。第二部分作者主要展示Runx2在不同种类细胞结合图谱，并与染色质可及性作关联。
3、Runx2与其他转录调控因子的潜在相互作用
下一步作者关注Runx2在不同细胞类型中的作用，将Runx2结合同时具有染色质可及性区域根据细胞种类进行划分（图3 A）。
首先寻找成骨细胞和软骨细胞中与Runx2一起发挥作用的TF，对这些区域peak进行motif扫描(图3 C)，结果发现除了已知的Runx motif外，AP-1的motif在三种细胞类型中都高度富集。而NF家族和NFAT家族虽然富集程度较弱，也在三种细胞类型中富集。相反，Forkhead家族在软骨细胞独有区域中富集，而bHLH家族motif在成骨细胞独有区域富集(图3 C)。
为了缩小候选TF的范围，通过比较moitf相关的TF在C2-Cho、C10- Cho和S7-Ob群体中的表达水平(图3D)。结果显示成骨细胞和软骨细胞均高水平表达ATF4，基于motif、表达水平和文献报道的生物学功能，Jun是软骨细胞和成骨细胞中Runx2的潜在共同调节因子，Foxa2是软骨细胞特异性的共同调节因子，Sp7是成骨细胞特异性的共同调节因子。
接下来作者使用软骨细胞做了Foxa2以及成骨细胞Jun的ChIP-seq，还利用公共数据库中软骨细胞Jun和成骨细胞Sp7的ChIP-seq数据，结果显示在软骨细胞中，Runx2、Jun和Foxa2共同结合在Col10a1基因座和上游区域，这些区域染色质在C10-Cho中处于开放状态。在成骨细胞中，Runx2、Jun和Sp7结合在Col1a2基因座附近S7-Ob独有的染色质可及性区域。第三部分作者主要关注与Runx2共同调控的转录因子。
4、敲除Runx2对成骨细胞染色质可及性的影响
研究转录因子的功能，敲低/过表达屡试不爽，因此作者构建Runx2敲除小鼠模型研究对成骨细胞分化的影响，结果显示在Sp7阳性成骨细胞中Runx2表达水平和活性缺失(图4A)。在胚胎第18.5天(E18.5)时，纯合Runx2敲除小鼠(Runx2 cHomo KO)的骨骼形成严重受损（图4B），在杂合Runx2 KO小鼠(Runx2 cHet KO)的同窝小鼠中则部分受损(图4B)。
下一步作者使用S7-Ob ATAC-seq数据作为Runx2野生型对照，对敲除小鼠模型颅骨细胞（Runx2 KO）进行ATAC-seq。PCA分析显示Runx2 KO细胞的染色质可及性模式与野生型和Runx2 cHet KO细胞明显不同(图4D)。
例如在野生型和Runx2 cHet KO细胞中，Spp1基因座上游区域染色质是开放状态，但在Runx2 KO细胞中则处于关闭状态(图4E)。
与对照相比，Runx2 KO细胞中有3311个染色质可及性区域发生了显著变化。敲除Runx2后，染色质可达性区域新增669个，减少2643个(图4F)。大多数差异可及性区域位于远端区域和增强子区，而不是TSS区(图4F)。Runx2敲除后染色质可及性降低区域与骨骼发育和骨化相关基因高度相关(图4H)。
motif分析显示，敲除Runx2后AP-1、NF和NFAT家族的motif在增加可及性区域富集，而Runx家族、Sp7-Dlx和AP-1的motif在失去染色质可及性的区域高度富集(图4I)。这些结果表明，Runx2是成骨相关基因的染色质可及性所必需的，并揭示了与其他转录因子(包括Sp7和AP-1)的潜在相互作用。第四部分作者构建Runx2敲除小鼠模型，验证Runx2的功能。
5、过表达Runx2对成骨细胞染色质可及性的影响
敲除后接下来就是过表达了，作者在NIH3T3成纤维细胞中过表达Runx2- BioFL，加入骨形成蛋白（BMP2）诱导成骨后的第0天和第3天进行ATAC-seq和Runx2的ChIP-seq。结果显示在第0天Runx2能与诱导成骨分化区域结合（染色质处于关闭状态），到第3天，这些区域表现出染色质可及性增加并维持Runx2的结合(图5C和5D)。
Runx2响应性可及性区域主要位于TSS远端(图5E)。对Runx2响应性区域的GO分析确定其与骨骼发育的关联性较强(图5F)。motif分析显示这些区域高度富集的Runx家族motif(图5G)。
这些结果说明Runx2可以作为先驱转录因子（pioneer TF）结合在骨骼发育相关基因远端增强子区域中并提升这些区域的染色质可及性。
最后通过CROP-seq和scRNA-seq作者还确定Runx2结合的增强子，并在体内进行了增强子活性的验证，这里就不再展开。
总结
- 通过ATAC-seq绘制骨骼发育分化过程中三种关键细胞类型的染色质可及性图谱，并发现Runx2 motif在基因座远端开放区域富集；
- 通过Runx2 ChIP-seq鉴定两条分化路径上Runx2结合的差异，并与染色质可及性作关联，初步发现Runx2与染色质可及性升高有关；
- ATAC-seq与ChIP-seq联合发现与Runx2共同调控分化的辅助TF，比如Jun、Foxa2和Sp7；
- 构建Runx2敲除小鼠模型，验证Runx2在分化过程中的调控作用，多个与分化相关基因染色质可及性下降；
- 构建Runx2过表达细胞系，发现Runx2作为先驱转录因子的作用；
- CROP-seq和scRNA-seq发现并验证Runx2结合的增强子。
参考文献
Hojo H, Saito T, He X, et al. Runx2 regulates chromatin accessibility to direct the osteoblast program at neonatal stages. Cell Rep. 2022 Sep 6;40(10):111315.
Doi: 10.1016/j.celrep.2022.111315
