技术支持
Support
没有商业化抗体,就不能做ChIP-seq了吗?
2019-01-16

商业化ChIP/IP级别的抗体是ChIP-seq的首选,但是我们也常常遇到没有合适商业化的情况,尤其是一些特殊物种或不常见的转录因子,这时我们就得另辟蹊径了。

 

 1. 使用近源物种的抗体

特殊物种没有商业化抗体、而相近的其他物种有抗体的情况,可比对目的蛋白序列在两个物种中的同源性,(可以用NCBI或Swiss-Prot数据库比对),若同源性在80%以上,就可以尝试跨物种使用该抗体。

 

2. 尝其他应用的抗体

我们可以尝试使用标注了IHC/IF/ICC等多种其他应用的商业化抗体。应用于这些实验的抗体通常是识别天然活性蛋白的结构和表位,和ChIP抗体识别的表位较为相似,因此可以尝试。

此外不建议尝试仅应用于WB或ELISA的抗体,因为在WB实验中,抗体识别的通常是变性蛋白的线性表位,并不适合ChIP实验,ELISA使用的抗体通常效价较低。

 

3. 表达重组标签蛋白,使用标签抗体

在细胞中表达带标签的重组目的蛋白,就可以使用对应的标签抗体(同样也是ChIP级别)进行ChIP实验。这种方法并不复杂,成功率也高,更重要的是非常通用,没有限制,因此我们会优先选择这种方法。

表达的过程:1.构建载体:构建含有目的蛋白编码序列+标签序列的重组质粒;2. 病毒包装:将表达载体和包装质粒共转染细胞,在细胞中进行病毒的包装;3.感染细胞:包装好的假病毒颗粒感染宿主细胞,目的基因进入宿主细胞,整合到基因组,表达目的蛋白。

常用的标签有6×His、Flag、HA、GST、GFP等,都可以非常容易的找到对应的ChIP级别抗体。

 

4. 自制抗体

通过制备抗原免疫动物获得抗体,通常也是没有办法的办法,但是自制抗体一般只能通过WB检测,ChIP实验的效果真不敢保证,所以选择自制抗体一定要做好失败的心理准备。