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RIP测序应用案例:卵巢癌中关键RBP调控RNA稳定性
2018-11-15

卵巢癌中关键的RBP——SORBS2

作者基于GEO数据库和cBioPortal数据库对卵巢癌相关的已知RBP基因进行筛选, 发现SORBS2显著影响卵巢癌细胞的转移克隆形成能力,SORBS2的低表达与卵巢癌患者不良预后相关。通过细胞实验和动物实验证明敲除SORBS2可增加卵巢癌细胞的迁移和成瘤能力。

 

寻找SORBS2调控的下游RNA

RIP-seq为了研究SORBS2结合、调控的靶标RNA,作者使用RNA免疫沉淀结合高通量测序(RIP-seq),即在卵巢癌细胞系A2780中表达带Flag标签的SORBS2蛋白,使用Flag标签抗体进行免疫沉淀,获得的RNA进行高通量测序。

RNA-seq调节RNA稳定性是RBP调控的方式之一,在这里,作者对RNA的稳定性进行了研究:使用药物α-amanitin鹅膏蕈碱分别处理敲除SORBS2A2780细胞和对照细胞,抑制RNA合成,在处理0h9h后提取RNA进行测序、qPCR,分析RNA的稳定性。

RIP-seqRNA-seq关联分析:SORBS2结合、且在敲除SORBS2后稳定性降低或不稳定的RNA91个,这些RNA的稳定性受到SORBS2调控,SORBS2可结合这些RNA并使之更加稳定。这些基因富集到丝粒组装等生物学功能、及FoxO信号通路。

 

SORBS2调控RNA稳定性并抑制肿瘤转移

作者发现,与肿瘤微环境有关的分泌蛋白WFDC1IL-17DRNASORBS2敲减后稳定性降低。SORBS2直接结合调节WFDC1IL-17D3’UTR区,通过结合3’UTR区域提高两者的稳定性,但是不改变3’UTR的长度,过表达SORBS2可提高RNA稳定。

SORBS2可以增加WFDC1IL-17D的稳定性,这种调控机制在肿瘤发生中起到怎样的作用?作者敲除SORBS2后,观察到细胞运动能力、细胞侵袭能力增加;若在SORBS2敲除的同时过表达WFDC1IL-17D,细胞运动能力、细胞侵袭能力则可恢复。动物实验(测转移结节)也得到了相同的结果。

 

ZnF_C2H2SORBS2蛋白的关键结构域

SORBS2主要包括三种结构域:SoHoZnF_C2H2以及SH3。作者分别针对这3种结构域构建删除突变体重组蛋白,确定SORBS2蛋白依赖ZnF_C2H2结合并稳定转录本,ZnF_C2H2的缺失会导致WFDC1IL-17D的稳定性降低、SORBS2不能抑制癌细胞迁移和肿瘤转移。

 

SORBS2影响分泌蛋白和肿瘤微环境

SORBS2敲减会导致分泌蛋白改变,并影响单核细胞向骨髓衍生抑制细胞(MDSC)和M2样巨噬细胞极化。而在敲减SORBS2的同时过表达WFDC1IL-17D可恢复细胞的正常极化。通过影响单核细胞向骨髓衍生抑制细胞(MDSC)和M2样巨噬细胞的极化,SORBS2稳定的分泌蛋白可以调节肿瘤微环境以进一步调控肿瘤转移。

该研究揭示了RNA结合蛋白SORBS2在卵巢肿瘤转移中的重要生物学作用,表征了通过SORBS2介导的转录本稳定化、将肿瘤微环境中的癌症发展和免疫调节联系起来的新转录后网络,为临床肿瘤患者发展新型诊疗策略提供了理论依据。

 

参考文献

Zhao L , Wang W , Huang S , et al. The RNA binding protein SORBS2 suppresses metastatic colonization of ovarian cancer by stabilizing tumor-suppressive immunomodulatory transcripts.[J]. Genome Biology, 2018, 19(1):35.