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 教你怎么巧用RIP测序玩转分子机制
2019-04-25

 教你怎么巧用RIP测序玩转分子机制
作者通过对一切编码RBP的基因进行了两次基于数据库的挑选打分将与卵巢癌相关的要害分子确认至SORBS2。  为了寻觅SORBS2的潜在下游靶点,RIP-Seq  将SORBS2-RNA复合物免疫富集,对SORBS2结合的RNA进行测序,高通量分子测序成果给出了和SORBS2结合的一切RNA分子。此外,转录本安稳性试验(Transcript
Stability
Assays)对SORBS2敲减细胞系中一切的转录本半衰期进行核算从而得到一切因为SORBS2敲减安稳性下降的转录本。比较SORBS2结合的转录本(来自RIP-Seq)数据集和转录本安稳性数据集(全转录组安稳性剖析),被SORBS2直接结合的转录本在SORBS2敲减后安稳性下降的转录本调集中有明显富集。该成果证明在卵巢癌傍边,SORBS2能够通过与转录本直接结合从而使转录本愈加安稳。SORBS2结合的转录本傍边,91个(8.38%)作为卵巢癌搬运SORBS2下游的潜在靶点。依据这些潜在靶点是否表达排泄蛋白进一步把规模缩小至7个基因,通过临床样本剖析、回补试验和其他分子生物学试验以及动物试验验证,由SORBS2直接结合的WFDC1和IL-17D在SORBS2敲减后下降,而且这两个基因能够按捺卵巢癌细胞搬运灶定殖。后续作业还清晰了SORBS2辨认而且安稳这些具有癌细胞搬运按捺作用转录本的作用域ZnF_C2H2,SORBS2敲减介导的排泄蛋白质组改动和单核细胞(monocyte)到骨髓衍生按捺细胞(MDSCs)和M2样巨噬细胞极化相关。



研讨一:从数据库中挑选确认SORBS2


基于RBP关于mRNA的转录后调控是否与卵巢癌细胞搬运以及免疫功用相关还不铲除,怎么树立RBP和该疾病的联络是首先需求回答的问题。基于三个准则和已经发表的文献对1345个RBP编码蛋白进行打分,三个打分条件别离是1)肿瘤安排中的表达量低于正常安排;2)搬运灶处表达量比原发处表达量低;3)与干细胞状态呈负相关。初筛将规模缩小至145  RBP基因。依据TCGA数库中这些基因的扩增(amplification)和删减(deletion)情况,确认其间四个BTF3、SORBS2、CIBRP和MEX3D最有可能与卵巢癌相关的基因。Transwell试验和siRNA试验证明SORBS2和MEX3D敲减能够增强卵巢癌细胞的搬运灶定殖才能。结合AOCS数据库猜测值,TCGA数据库的GSEA剖析成果(TGF-beta和细胞黏附)均进一步证明SORBS2是按捺卵巢癌搬运的要害RBP。临床样本信息库(CSIOVDB、West
China cohort of ovarian
cancer)相同证明SORBS2与卵巢癌患者的医治效果相关,临床分级越高,癌细胞分解程度越高且患者预后越差时,SORBS2表达下调越明显。同时分子试验证明,在卵巢癌细胞系中缄默沉静SORBS2在体内体外均增强卵巢癌细胞的搬运,但不影响这些细胞的增值和成长速率。


研讨二:高通量测序成果确认WFDC1和IL-17D


已然SORBS2的细胞表型与功用都已确认,那么这一重要的RBP怎么在卵巢癌细胞中发挥作用?哪些SORBS2靶标最要害?云序生物RIP测序成果给出一切SORBS2直接结合的靶点,联合全转录组规模RNA安稳性试验以及全转录组测序成果证明SORBS2能够与部分转录本结兼并使他们愈加安稳,其间91个基因被确认。功用剖析(GO剖析和KEGG通路剖析)表明这些基因发挥着丝粒组装等生物学功用并富集于FoxO等信号通路。这91个基因中仅7个基因能够编码排泄蛋白,其间WFDC1和IL-17D在SORBS2敲减后安稳性降低。分子试验证明无论过表达或许缄默沉静SORBS2,WFDC1和IL-17D安稳性相对应的增强或削弱。SOSRBS2调理两者安稳性的方法是结合3’UTR区域而不改动3’UTR的长度。清晰SORBS2与WFDC1和IL-17D的联络之后,这种结兼并安稳的关系在卵巢癌细胞中发挥怎样的生物学功用?临床信息显示,SORBS2表达量低的患者样本中WFDC1和IL-17D的表达量也相对较低。无论动物试验(测搬运结节)仍是细胞试验(Transwell侵袭模型),回补过表达WFDC1或许IL-17D都能按捺卵巢癌细胞的搬运才能或侵袭才能。


研讨三:结合功用域和免疫调理


SORBS2主要含有三种结构域,SoHo、ZnF_C2H2以及SH3,  三个骤变试验别离对应骤变一个结构域。卵巢癌细胞转染试验以及动物试验发现ZnF_C2H2是SORBS2结兼并安稳转录本时所必须的功用结构域。已然WFDC1和IL-17D都是SORBS2低表达癌症细胞的排泄因子,那么它们是否对卵巢癌细胞搬运的肿瘤微环境有影响?试验证明SORBS2敲减介导排泄蛋白改动与单核细胞、MDSC和M2型巨噬细胞极化相关,SORBS2在肿瘤微环境中有安稳转录本和免疫调理作用。源于癌症的SORBS2安稳的排泄蛋白体能够有效地按捺卵巢癌搬运并调理体内肿瘤促进性骨髓细胞的积累。

 

 

 

 

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