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 RIP测序试验流程
2019-05-11

​   RIP试验流程
RIP技术(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RNA结合蛋白免疫沉积),是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术。剖析与目的蛋白结合的RNA.运用针对方针蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉积下来,然后通过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行剖析;即用抗体或表位符号物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白,防止非特异性的RNA的结合,免疫沉积把RNA结合蛋白及其结合的RNA一同分离出来,结合的RNA序列可通过microarray(RIP-Chip),定量RT-PCR或 高通量测序(RIP-Seq)方法来判定。是了解转录后调控网络动态进程的有力东西,能协助咱们发现miRNA的调理靶点。
      RIP测序试验流程

(一). 细胞裂解液获取

A. 单层细胞或者贴壁细胞处理

1. 冷PBS清洗培养皿或培养瓶中的细胞两次

2. 参加冷PBS后用细胞刮将细胞刮下来,搜集至enpendoff管

3. 1500rpm,4℃离心5min,弃上清,搜集细胞

4. 用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞,吹打均匀后于冰上静置5min

5. 每管分装200ul细胞裂解液,储存于-80℃

B. 悬浮细胞处理:先搜集细胞再计数,然后清洗裂解

C. 安排样品处理

1.冷PBS清洗新鲜切下的安排三次

2. 参加冷PBS后,用匀浆器或其他细胞分离设备使安排涣散为单个细胞,计数

3. 1500rpm,4℃离心5min,弃上清,搜集细胞

4. 用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞,吹打均匀后置于冰上静置5min

5. 每管分装200ul细胞裂解液,储存于-80℃

(二). 磁珠的预备

A. 试验前预备

1、enpendoff管

2、磁力架

3、冰盒, RIP Wash
Buffer置于冰上

4、抗体,置于冰上

5、涡旋震动器

6、枪、枪头放于超净台照耀30min,枪喷DEPC水

B. 磁珠预备进程

1. 重悬磁珠

2. 符号试验所需的enpendoff管,样品包括目的样品,阴性对照与阳性对照

3. 汲取50ul 重悬后的磁珠悬液于每个enpendoff管

4. 每管参加500ul RIP Wash
Buffer,涡旋震动

5.将enpendoff管置于磁力架上,并左右滚动15°使磁珠吸附成一条直线,去上清,重复一次

6.用100ul的RIP Wash Buffer重悬磁珠,参加约5ug相应抗体于每个样品中

7. 室温孵育30min

8. 将enpendoff管置于磁力架上,弃上清

9. 参加500ul RIP Wash
Buffer,涡旋震动后弃上清,重复一次

10. 参加500ul RIP Wash
Buffer,涡旋震动后置于冰上

(三). RNA结合蛋白免疫沉积

A. 预备工作

1、冰盒

2、360°旋转仪

3、RIP Wash
Buffer 、0.5M EDTA 、RNase Inhibitor 置于冰上

B. RNA结合蛋白免疫沉积试验进程

1.预备RIP
Immunoprecipitation Buffer

2.将前上步的enpendoff管放磁力架上,去上清,每管参加900ul RIP
Immunoprecipitation Buffer

3. 敏捷解冻**步制备的细胞裂解液,14,000rpm,4℃离心10min。汲取100ul上清液于上一步的磁珠-抗体复合物中,使得总体积为1ml

4. 4℃孵育3h至过夜

5. 短暂离心,将enpendoff管放在磁力架上,弃上清

6. 参加500ul RIP Wash
Buffer,涡旋震动后将enpendoff管放在磁力架上,弃上清,重复清洗6次

(四). RNA纯化

A. 试验前预备

1.枪、枪头、enpendoff管紫外照耀30min,喷DEPC水以除RNA酶

2. Salt SolutionⅠ、Salt SolutionⅡ、RIP Wash Buffer、Proteinase K、10%SDS、 Precipitate Enhancer 置于冰上

3.RNase-free的乙醇、氯仿、异戊醇

4.DEPC水置于冰上

5. 离心机预冷

6. 冰盒

B. RNA纯化进程

1.预备Proteinase K
Buffer。每个样品需150ul

2.用150ul
Proteinase K Buffer重悬上述磁珠-抗体复合物

3. 55℃孵育30min

4. 孵育完之后,将enpendoff管置于磁力架上,将上清液吸入一新的enpendoff管中

5. 于每管上清液中参加250ulRIP WashBuffer

6. 于每管参加400ul苯酚:氯仿:异戊醇,涡旋震动15s,室温下14,000rpm离心10min

7. 当心的汲取350ul上层水相,吸入另一新的enpendoff管

8. 于每管参加400ul氯仿,涡旋震动15s,室温下14,000rpm离心10min

9. 当心的汲取300ul上层水相,吸入另一新的enpendoff管

10. 每管参加50ul Salt
SolutionⅠ,15ul Salt
SolutionⅡ,5ul Precipitate Enhancer ,850ul 无水乙醇(无RNase),混合,-80℃坚持1h至过夜

11. 14,000rpm,4℃离心30min,当心去上清

12. 用80%乙醇冲洗一次,14,000rpm,4℃离心15min,当心去上清,空气中晾干.

13. 10-20ul DEPC水溶解,-80℃保存,送测序或进行下流试验。 

 



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