20230303康测科技助力郑大附一内分泌科秦贵军团队发表Cell Proliferation

本期带来的是康测科技RIP-seq的客户文献，该文献主要通过寻找糖尿病肾病（DKD）肾小管细胞中特异表达的lncRNA出发，探讨lncRNA在DKD疾病中的作用和调控机制。其中RIP-seq主要贡献是提供RBMX与PWARSN lncRNA结合的证据和区域，为RIP-qPCR引物设计提供指导。

糖尿病肾病(DKD)是世界范围内导致终末期肾脏疾病的主要原因。先前的研究集中于肾小球的病理损伤；然而，多项研究可以证实肾小管损伤在DKD的进展中起的关键作用。糖尿病环境中的代谢紊乱、血流动力学变化和氧化应激可导致肾小管炎症、近端肾小管上皮细胞(PTEC)死亡和间质纤维化，最终发展为DKD。然而，在DKD中启动和介导肾小管上皮细胞损伤的病理机制仍不清楚。

硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)属于硫氧还蛋白家族，与硫氧还蛋白结合，可以抵抗静息细胞中的氧化应激。许多研究报道，高血糖促进TXNIP与硫氧还蛋白的分离，导致过度的氧化应激和活性氧（ROS）的产生。之前的研究报道显示TXNIP在DKD的进展中具有关键作用。TXNIP诱导的ROS积累在DKD中以NLRP3炎症依赖的方式启动细胞焦亡。越来越多的证据表明lncRNA参与DKD的调节，但是lncRNA对DKD肾小管损伤的影响处于未知状态。为了深入了解DKD发展的分子机制，寻找新的分子标记比如lncRNA，提高DKD诊断和治疗的水平，作者开展了如下研究。

1.DKD患者TXNIP和NLRP3表达水平异常并引起肾小管上皮细胞焦亡

作者首先收集糖耐量正常(NGT)的患者、Ⅱ型糖尿病(DM)但未患DKD的患者以及DKD患者的组织样本，免疫荧光分析显示DKD患者肾组织线粒体活性氧(MitoROS)和ROS水平显著升高，并伴有NLRP3炎症体(NLRP3、ASC和Caspase-1)共存增加(图B、D)；同时检测TXNIP和NLRP3炎症体的表达水平，通过免疫组化证实TXNIP、NLRP3、ASC和Caspase-1的表达水平显著升高(图E)。

接下来，作者对于TXNIP在正常糖(NG)和高糖(HG)条件下培养的PTEC(HK-2细胞)激活NLRP3炎症体和细胞焦亡的作用进行了评估。通过IncuCyte法检测细胞动态死亡和超微结构改变，以及扫描电子显微镜结果，证实了TXNIP诱导的NLRP3炎性小体激活和随后的细胞焦亡参与了DKD的发展。

2. PTEC特异的lncRNA PWARSN在病理上与DKD相关

为了探索TXNIP/NLRP3信号在DKD肾小管中激活的分子机制，作者对NG和HG处理72 h的HK-2细胞进行了全转录组RNA芯片分析,(康测科技lncRNA-Seq亦可实现此需求），结果显示HG组细胞中TXNIP mRNA表达水平显著上调，在构建的lncRNA-TXNIP共表达网络中鉴定出11个与TXNIP相关的lncRNA，qRT-PCR验证后鉴定出5个特异表达的lncRNA，lncRNA PWARSN(也称为NR_0221011)表达水平在HG组明显升高，PWARSN在物种间的保守性很差并且无编码能力，随后敲低PWARSN后对TXNIP的mRNA和蛋白水平有影响（图A/B)，因此作者选择PWARSN进行进一步研究。

作者对肾脏进行了荧光原位杂交(FISH)分析，发现PWARSN主要位于DKD患者的肾小管(图C)。

然后检测了32例NGT患者、22例DM但无DKD患者和15例DKD患者的肾小管PWARSN、TXNIP和NLRP3的表达，qRT-PCR结果显示，DKD患者PWARSN、TXNIP和NLRP3基因表达水平显著高于NGT和DM患者，但在NGT和DM患者中表达量没有显著变化（图D-F)。而且发现PWARSN和TXNIP及NLRP3 mRNA水平之间存在很强的相关性（图G/H)。这表明PWARSN与DKD肾小管中的TXNIP/NLRP3密切相关。亚细胞定位显示PWARSN分布于PTEC的细胞质和细胞核中（图J/K)。

3. PWARSN可以触发TXNIP/NLRP3诱导的肾小管上皮细胞焦亡

为了进一步探索PWARSN在PTEC中的生物学功能，作者使用慢病毒系统过表达PWARSN，并使用CRISPR-Cas9系统在HK-2细胞中敲除PWARSN，结果显示过表达PWARSN可以促进ROS和mitoROS 的生成(图A)；CO-IP结果表明TXNIP-NLRP3相互作用在PWARSN过表达细胞中得到增强，但在敲除PWARSN细胞中受到抑制（图B)。扫描电子显微镜和TEM（图C）、IncuCyte 测定（图D）和HK-2细胞中的PI染色（图E）结果表明PWARSN可以促进PTEC细胞焦亡，并进行了WB验证（图F)。

下一步将人PWARSN质粒转染到小鼠肾小管上皮细胞 (mRTEC) 中，检测各项生化指标发现AAV9-PWARSN注射8周后小鼠肾损伤生化指标升高，但体重或血糖水平无明显影响；肾小管细胞萎缩增加、肾小管基底膜增厚和焦亡mRTEC超微结构显著改变（线粒体肿胀和嵴丢失）（图A-C)；免疫荧光染色结果显示PWARSN促进mitoROS和ROS积累；PWARSN在mRNA和蛋白质水平上引起 TXNIP 和细胞焦亡相关蛋白表达的累加上调(图D-G)。总体这些结果表明PWARSN是一种非保守的人类lncRNA，在调控TXNIP/NLRP3诱导的DKD肾小管细胞焦亡中发挥保守功能。

4. PWARSN的靶标miRNA

为了进一步研究PWARSN调节DKD中TXNIP/NLRP3诱导的细胞焦亡的详细机制，作者寻找其靶标miRNA。首先通过ceRNA网络分析确定一些PWARSN和TXNIP相关的miRNA靶标（图A）。这些miRNA在HG组中下调表达，然而miR-372-3p在敲低PWARSN细胞中上调，在过表达PWARSN细胞中下调（图B、C）。FISH结果显示在敲低PWARSN后miR-372-3p表达水平增加（图D），通过RIP-qPCR(康测科技可以提供）、RNA相互作用组学和双荧光酶报告分析证实了miR-372-3p与PWARSN的结合（图G-I)。

WB结果显示miR-372-3p调控HK-2细胞中的TXNIP和细胞焦亡相关蛋白的表达。使用miR-372-3p抑制剂可以消除敲除PWARSN诱导的TXNIP表达水平的下调；使用miR-372-3p mimics可以消除过表达PWARSN诱导的TXNIP水平上调（图J，K）。随后过表达PWARSN可以增加TXNIP和NLRP3的蛋白水平，但含有与miR-372-3p结合的PWARSN的3’UTR突变序列的质粒不影响TXNIP和NLRP3的蛋白水平（图L）。总的来说，这些发现表明 PWARSN的调控功能部分依赖于miR372-3p。

5. 核内PWARSN通过泛素化-蛋白酶体途径促进RBMX降解

考虑到PWARSN定位在细胞质和细胞核中，而lncRNA的作用取决于它们在细胞中的亚细胞定位。作者着重关注核内PWARSN的功能，通过ChIRP- MS未能检测到PWARSN和TXNIP蛋白之间的直接相互作用，但发现了可以调控lncRNA和TXNIP表达水平的RBMX蛋白。后续作者通过RNA Pull-down后WB、RIP-qPCR、FISH技术进一步证实了RBMX和PWARSN之间的相互作用和共定位（图A-C)。

作者发现PWARSN敲除后，HK-2细胞中RBMX蛋白水平增加，但是mRNA水平没有增加（图D/E)，那么PWARSN是如何从蛋白水平调控RBMX的呢？随后使用放线菌酮（蛋白合成抑制剂）处理HG细胞，发现RBMX蛋白水平降低，但是敲除PWARSN细胞没有受到影响（图F)；进一步使用蛋白酶体抑制剂MG-132处理后，NG细胞和过表达PWARSN细胞中RBMX蛋白水平升高（图G)；过表达PWARSN或者敲除可以影响HK-2细胞中的RBMX泛素化降解（图H/I)，这些结果也说明PWARSN对RBMX蛋白水平调控是通过泛素化-蛋白酶体途径进行的。

6. PWARSN通过与RBMX相互作用调控TXNIP表达水平

PWARSN调控TXNIP表达依赖于RBMX泛素依赖性降解，而且RBMX具有转录因子功能，那么PWARSN具体是如何协作调控TXNIP表达呢？作者在康测科技进行RIP-seq，根据RIP-seq结果设计引物，通过RIP-qPCR证实RBMX在TXNIP mRNA上具有多个结合位置（图A)。随后进行荧光素酶报告基因分析，发现过表达RBMX和敲除PWARSN均可以降低由RBMX驱动的TXNIP启动子的荧光素酶活性（图B/C)，然后作者克隆TXNIP启动子序列（TSS -2000到+200）构建荧光素酶载体，结果表明距离启动子-700到-300处的转录活性显著降低(图D)。

先前有研究表明RBMX招募增加H3K9me3修饰水平来调控基因沉默，通过H3K9me3 ChIP-qPCR（康测科技也可提供），发现HG组TXNIP启动子区H3K9me3的富集程度降低，但是过表达RBMX或敲除PWARSN后，富集程度增加（图E-H)；

过表达RBMX可以下调HG处理细胞中TXNIP的表达水平，而敲低RBMX产生相反的效果；另外通过沉默DICER阻断miRNA产生后，敲除PWARSN无法影响沉默RBMX细胞中的TXNIP表达水平。综上所述，作者推断PWARSN可能作为诱饵并从TXNIP启动子中去除RBMX蛋白以及其它结合物，导致H3K9me3修饰减少并激活TXNIP转录（图I-J)。

最后作者探讨了PWARSN用作DKD的生物标志物的可行性，这里不再展开。

1. 免疫组化结果显示DKD患者样本中TXNIP、NLRP3表达明显上调，通过IncuCyte法和扫描电镜确定；

2. 通过全转录组芯片分析发现PTEC特异的lncRNA PWARSN，通过FISH、qRT-PCR证明DKD患者PWARSN位于细胞质和细胞核，表达水平与TXNIP和NLRP3一样，均高于非DKD患者；

3. 过表达/敲低验证PWARSN可以促进/抑制细胞焦亡；

4. ceRNA分析找到候选靶标，RIP-qPCR、双荧光素酶酶报告系统、互作组确定PWARSN靶标miR-372-3p；使用miRNA抑制剂和mimics可以消除敲除PWARSN诱导的TXNIP表达水平的下调；使用miR-372-3p mimics可以消除过表达PWARSN诱导的TXNIP水平上调；

5. ChIRP-MS发现调控TXNIP和PWARSN的RBMX蛋白，利用RNA pull-down后WB、RIP-qPCR和FISH验证RBMX与PWARSN的结合；

6. 敲除PWARSN后，RBMX mRNA水平不变，蛋白水平下降，使用放线菌酮和蛋白酶体抑制剂发现PWARSN对RBMX蛋白水平调控是通过泛素化-蛋白酶体途径进行的；

7. RBMX本身具有转录因子功能且影响H3K9me3水平，康测科技RIP-seq和RIP-qPCR帮助作者验证RBMX在PWARSN上有多个结合位点，通过双荧光素酶报告系统发现过表达RBMX和敲除PWARSN均可以降低由RBMX驱动的TXNIP启动子的荧光素酶活性；

8. H3K9me3 ChIP-qPCR发现HG组TXNIP启动子区H3K9me3的富集程度降低，但是过表达RBMX或敲除PWARSN后，富集程度增加，说明PWARSN可能作为诱饵并从TXNIP启动子区中去除RBMX蛋白以及其它结合物，导致启动子区H3K9me3修饰减少并激活TXNIP转录。

Song Y, Guo F, Zhao YY, et al. Novel lncRNA-prader willi/angelman region RNA, SNRPN neighbour (PWARSN) aggravates tubular epithelial cell pyroptosis by regulating TXNIP via dual way in diabetic kidney disease. Cell Prolif. 2023;56(2):e13349.