本系统属于“MRD一站式自动化解决方案”的一部分，为“分析报告一体机”的核心功能之一。其主要功能为根据提供的待检测位点列表，设计用于不对称多重PCR的Tag引物池。该引物池合成后，和内参引物一起，对添加了SMP接头的DNA进行多重PCR靶向扩增，最终形成SMP测序文库。本系统对每一个待检测位点同时设计F和R两条引物，均带有illumina的P7 tag，F和R组合不扩增，仅分别和SMP接头上的P5 Tag扩增。

本系统使用简单，无技术门槛，登录后导入WES位点的VCF文件，即可对位点根据AF或临床意义进行筛选，对Tm值、引物长度、引物距离位点的距离等进行简单设置后，即可进行引物设计。系统推荐一次针对50个以下的位点进行设计（无上限），每一个位点设计F/R共10条引物。

引物设计完毕系统会自动进行全基因组扫描，进行脱靶检测，综合引物距位点距离、Tm值、引物内自由能、引物间二聚体、GC含量等一系列信息，保留最优的5条F引物和5条R引物，供用户人工核对，选择最佳引物合成。

产品优势和性能

A、完全自主，无供应商依赖：引物设计出后，合成的上游供应商众多，无需依赖特定供应商；

B、位点无限制：基因组上的任意位点均可进行检测，无需依赖探针库，大大提高了MRD检测的可行性和准确性；

C、极速：引物设计系统运行时间约为10min，引物合成时间1个自然日，较捕获探针合成周期大大缩短，提高检测效率；

D、上靶率高：上靶率70%-80%，远高于基于探针的一次捕获的上靶率；

E、均一性好：不同靶点之间覆盖度均一；

F、成本低：MRD引物合成的成本远低于探针设计合成的成本；

设计成功率高、均一性好：

为测试软件的引物设计性能，我们使用3个商品化ctDNA标准品和一个临床样本，根据各自突变信息，每个样本分别选择了 30-50个位点

进行引物设计。如下图所示，每次设计的引物位点成功率都在90%以上（成功率标准：被设计位点的引物经靶向扩增、测序后，Depth >1000)。同时，设计出的多重引物扩增均一，Depth > 5000的位点都在90%以上。

下图是一个样品的Depth分布示例，结果显示位点质检Depth分布均一。

上靶率高：

下表为其中一个靶向扩增Panel，使用不同AF值的ctDNA标准品，进行靶向扩增建库的测序结果。

> 数据的比对率都在95%以上，上靶率在85%左右;

> 其中40%的Reads具有双链支持，可以大幅提高纠错能力;

> 产物进行了160000x的测序，经UMI和SID去重后，被检位点的平均有效Depth接近10000x，满足MRD检测的要求；

> 靶向区域的覆盖度达到100%。

引物稳定性好：

我们使用不同的模板量测试设计出的引物性能，发现从5ng到40ng，性能都很稳定。

KC-Primer是一套性能优异的多重扩增靶向测序个性化Panel设计系统

全面兼容WES数据

让用户自主设计Panel进行MRD成为可能