20230210 如果Pol II想要跑，稳定G4可以留

转录因子、染色质相关蛋白、组蛋白修饰和DNA甲基化等作为表观遗传学明星已被研究许多年，除此之外，DNA二级结构也存在转录调控功能，其中研究最多的便是G4结构。G4结构主要在基因启动子区形成并提升基因表达水平。本次带来的文献与康测科技新开发的G4-ChIP-seq产品有关，该文献从染色质状态入手，主要讨论启动子区G4结构在不同染色质状态下的变化情况以及RNA聚合酶II（Pol II）的结合情况。

G4结构在人基因组中主要定位于启动子区，G4-ChIP数据显示内源性G4结构富集在转录起始位点（TSS）上游的无核小体区（nucleosome-depleted region, NDR）。如果某个基因启动子区存在内源G4结构会具有更高的转录活性。组蛋白去乙酰化酶抑制剂导致的染色质松弛（Chromatin relaxation）也会增加G4结构的形成。由于超过99%的内源性G4结构与转录因子（TF）结合位点重叠，这种基因表达水平升高可能是由于启动子区G4结构的TF占据增加和招募Pol II引起的。基于前文的结果，那么具有转录活性的基因启动子处的G4结构形成是转录活性增加的原因还是结果？作者因此开展G4-ChIP-seq、RNA Pol II ChIP-seq和ATAC-seq来回答这个问题。

1. G4结构形成是Pol II结合启动子增加的标志

作者首先使用K562细胞作为研究对象，使用G4-ChIP-seq、Pol II ChIP-seq和ATAC-seq分别鉴定G4结构位置、Pol II位置以及染色质开放区域。G4-ChIP鉴定到的peak可以使用DNA聚合酶停滞试验（G4-seq）来验证，结果显示76.1%的peak可以在体外形成G4结构（下图左）；作者定义TSS上下游500 bp为启动子区，而G4 peak主要在启动子区富集（下图右）。与数据库中转录组数据联合分析发现，启动子区具有G4结构标记的基因表达水平显着增加。

ATAC-seq结果显示G4结构（88.2%）大部分处于NDR区域（染色质可及区），例如MYC和KRAS启动子区（下图）。

Pol II ChIP-seq结果显示相比无G4结构的启动子，G4启动子区具有较多的Pol II占位（下图）。

为了阐明G4结构形成是否受到活跃的转录状态的影响，以及G4结构形成是否受更开放与更紧凑的染色质环境调控，作者将集中研究Pol II占位的G4启动子。

2. 启动子区G4结构形成不依赖活跃的转录状态

为了研究G4结构形成是否依赖活跃的转录状态，作者使用DRB抑制转录延伸过程，来看转录抑制是否可以造成启动子区G4结构的消失。将DRB处理和DMSO处理的K562细胞同时进行G4-ChIP-seq，结果显示启动子区G4结构在DRB处理后并没有发生显著变化（下图）。因此抑制Pol II依赖性延伸过程不会导致启动子处G4结构的消失，说明G4结构形成是在转录延伸之前。

为了评估抑制转录起始过程是否会导致启动子G4结构消失，作者使用TPL（共价抑制Pol II相关的解旋酶XPB）处理后进行G4-ChIP-seq，结果显示TPL抑制转录起始过程并未显着降低整体启动子G4的信号；反而TPL处理后会使启动子区G4信号增加（下图）。作者的结果与早期研究结果相反（活跃转录状态可以产生更多的G4结构），作者证明活跃转录状态与启动子区G4结构形成无关。

3. 启动子区G4结构折叠对染色体压缩敏感

考虑到转录抑制不能去除启动子区的G4结构，而且抑制组蛋白去乙酰化酶活性造成染色质松弛可以增加G4结构的形成，作者假设染色质开放状态会影响G4结构的形成。使用缺氧诱导染色质压缩（H3K9me3修饰水平上升，组蛋白乙酰化水平下降），对缺氧处理和常氧对照的K562细胞进行ATAC-seq和G4-ChIP-seq，结果显示常氧状态下，相比无G4结构的启动子（Pol II+ G4+），具有G4结构的启动子（Pol II+ G4+）定位在跟开发的染色质区域（下图）。

诱导缺氧状态下可以导致大多数G4启动子区域的ATAC-seq信号强度显着降低（下图）。

诱导缺氧状态下，20%左右的启动子区G4的信号显着降低（下图），这说明许多启动子区G4结构对染色质压缩敏感。

另外，缺氧状态下的具有G4启动子区的Poll II信号强度整体下降（下图左），Pol II信号丢失几乎完全发生在G4结构减少的区域（下图右）。

具体基因的各组学reads覆盖度图也能佐证（下图），说明染色质压缩导致许多启动子区G4结构的损失，并伴随Pol II结合的丢失。

4. 通过小分子稳定G4结构可以抵消缺氧状态下G4结构和Pol II信号丢失

为了确定G4结构稳定性是否影响缺氧状态下G4的形成，作者使用小分子pyPDS来稳定G4结构，核成像结果显示G4信号明显增加，说明pyPDS可以阻止低氧状态下G4结构的解开。

作者首先利用ATAC-seq确定pyPDS处理不会明显改变缺氧状态下的染色质可及性，结果显示染色质大部分还是处于压缩状态下，如下图。

下一步作者观察缺氧条件下，稳定的G4结构能否留住Pol II的结合，ChIP结果显示pyPDS处理可以使缺氧条件下Pol II结合损失减少10倍（下图上），例如BRD4和CBX1（下图下）。

另外在常氧状态下pyPDS处理或缺氧状态下非G4结构启动子区Poll II结合没有发生明显改变（下图）。

这些结果共同说明在染色质压缩过程中维持G4结构可以保留Pol II的结合。

作者利用G4-ChIP-seq、Pol II ChIP-seq和ATAC-seq，从染色质状态入手，探讨启动子区G4结构的形成和变化情况，结果说明G4结构形成在转录起始之前，并且染色质压缩会导致G4结构的消失，让我们总结下作者的工作：

1. 通过G4-ChIP-seq、Pol II ChIP-seq和ATAC-seq确定K562细胞G4结构定位、Pol II结合情况以及染色质可及性状态；

2. 分别使用DRB（抑制转录延伸）和TPL（抑制转录起始）处理后，通过G4-ChIP-seq发现G4结构形成不受活跃转录状态影响；

3. 利用缺氧处理K562细胞造成染色质状态全局压缩，通过ATAC-seq确认染色质可及性降低，再通过G4-ChIP-seq发现启动子区G4结构大部分消失；同时Pol II ChIP-seq结果显示G4结构启动子区Pol II结合变少；

4. 最后通过小分子G4结构稳定剂pyPDS处理，在缺氧状态下维持启动子区G4结构可以保留Pol II在启动子中的结合。

Shen, J., Varshney, D., Simeone, A. et al. Promoter G-quadruplex folding precedes transcription and is controlled by chromatin. Genome Biol 22, 143 (2021).

DOI: 10.1186/s13059-021-02346-7