20221223 ac4C修饰位置小差别，发挥功能大不同

关于mRNA上ac4C修饰，康测科技已发表两篇文献解读，一篇acRIP-seq:主要研究CDS区ac4C修饰对mRNA稳定性和翻译效率的影响（下图左）；另一篇是改良的ac4C-seq：主要研究5’UTR区ac4C修饰对mRNA翻译起始和效率的影响，但是对其稳定性没有影响（下图右）。本次带来的文献是发生在3’UTR区的ac4C修饰，其对mRNA稳定性的维持具有重要作用；通过acRIP-seq作者发现了哪些结果呢？我们一起来看看吧。

NAT10属于GCN5相关的N-乙酰转移酶（GNAT）家族，是一种赖氨酸乙酰转移酶，可以乙酰化各种RNA和蛋白，比如自噬调节因子Che-1和α-微管蛋白。GNAT家族可以调节骨代谢疾病，其中NAT10更是与多种疾病有关，如儿童早衰症、肝细胞癌和乳腺癌等。

ac4C是存在于tRNA，rRNA和mRNA上的保守化学修饰，NAT10催化tRNA或rRNA上的ac4C修饰，可以增加蛋白质翻译中的保真度或准确性。ac4C是在mRNA上发现的第一个乙酰化修饰，与许多疾病的发展和预后有关。

骨髓间充质干细胞（BMSCs）具有多向分化能力，在干细胞治疗中得到了广泛的应用，其成骨分化能力有助于骨形成，并且BMSCs细胞的成骨异常分化会导致各种疾病的产生。RUNX2是调控成骨细胞分化和骨骼发育的关键转录因子，那么RUNX2和ac4C修饰能碰撞出什么火花？又会影响什么生物学过程呢？我们接下来看正文。

1. NAT10表达和ac4C修饰水平在骨质疏松症中下调

为了评估NAT10的表达和骨质疏松性骨组织中ac4C修饰水平，通过qPCR和ac4C dot plot发现与对照组相比，骨质疏松和双卵巢切除（OVX）小鼠股骨中NAT10的mRNA表达水平（图A、B）和总RNA中ac4C修饰水平（图D、F）均显著降低。

接着使用免疫荧光染色来检测成骨细胞中NAT10在骨质疏松中的表达情况，发现骨钙素成骨细胞中，骨质疏松和OVX小鼠股骨切片中NAT10的表达显著降低。表明NAT10可能参与了骨质疏松症的病理过程。

2. NAT10的过表达可以促进OVX中的骨组织形成

为了测试NAT10是否是骨组织形成的调控因子，作者使用过表达NAT10的腺病毒并将其肌内注射到C57BL/6小鼠中。结果显示，NAT10过表达OVX小鼠的骨组织中NAT10的蛋白质水平显著增加（下图B、C）。

骨微结构参数的定量测量显示，OVX小鼠的小梁骨体积分数（BV/TV）、小梁数量（Tb.N）和小梁厚度（Tb.Th）降低，小梁分离（Tb.Sp）和BSA/BV增加，但OVX小鼠中的这些参数都被过表达NAT10所逆转，在对照组小鼠中也没有显著差异（下图G-K）。这些结果表明NAT10是预防骨质疏松的保护因子。

3. NAT10抑制剂Remodelin处理可以负向调节OVX小鼠的骨量和密度

下一步为了探究抑制NAT10的活性是否会影响骨组织形成，作者每2天通过口服管饲法将NAT10的特异性抑制剂——Remodelin溶液（100 mg/kg）递送给OVX小鼠和对照组小鼠。结果显示处理后NAT10的蛋白表达并没有发生显著变化（下图B、C），但是OVX小鼠的整体ac4C修饰水平显著降低（下图D）。

骨微结构参数的定量测量显示Remodelin加重了OVX小鼠的小梁骨质流失，而假手术组小鼠的骨量保持不变（下图G-K）。因此Remodelin可能会加重OVX小鼠的骨质流失。

4. BMSCs成骨分化过程中总RNA的ac4C修饰水平和NAT10表达水平升高

之前得到的体内实验结果，让作者假设NAT10可以通过ac4C修饰水平调控BMSCs的成骨细胞分化过程，于是从健康小鼠骨髓中分离出BMSCs，并通过流式细胞术鉴定其表型。结果显示ARS（茜素红S）染色显示钙结节形成增加；ALP （碱性磷酸酶）染色显示，在成骨培养基（OM）中培养的BMSCs中ALP蛋白水平升高，但在增殖培养基（PM）培养的BMSCs蛋白水平没有升高（下图A-D）。

另外，在BMSCs成骨分化早期，NAT10的蛋白质水平和总RNA的ac4C修饰水平同时增加，表明早期NAT10的表达水平和ac4C修饰水平增加可能与BMSCs的成骨分化有关。

5. NAT10对体外BMSCs成骨分化有正向调控作用

为了确定NAT10是否影响成骨分化过程，作者用慢病毒系统在BMSCc中过表达或沉默NAT10，dot plot结果显示在成骨分化的第14天，与对照组相比，过表达NAT10后总RNA的ac4C修饰水平增加，沉默NAT10后则降低（如下图A、B）。

ARS染色和ALP活性检测BMSCs的成骨分化能力，结果也显示过表达NAT10的BMSCs形成较多的钙结节，而沉默NAT10与Remodelin处理的BMSCs一致，会形成较少的钙结节（下图C-H）。

接着通过检测成骨分化标志物如RUNX2和OSX的表达水平，发现过表达NAT10会导致RUNX2和OSX的表达水平增加，而沉默NAT10或用Remodelin处理可以使RUNX2和OSX的表达水平降低（下图I-K）。

这些结果共同说明NAT10可以通过增加RNA的ac4C修饰水平来促进BMSCs的成骨细胞分化过程。

6. acRIP-seq鉴定NAT10的靶标基因

为了找到NAT10在成骨分化过程中的靶标，作者同时对沉默NAT10（siNAT10）和对照（siNC）进行acRIP-seq，motif与之前报道一致（下图B），呈现CXX的模式。

与之前报道不同的是，作者的acRIP-seq的peak在3′UTR分布较多（下图C）。

GO富集分析显示发生差异ac4C修饰水平的基因集中在Hippo信号通路、mRNA加工、成骨细胞分化等通路上（下图E）。

作者在成骨细胞分化通路中发现四个候选靶标：RUNX2、COL1A1、TNC和SMAD3，其中RUNX2是决定BMSCs的成骨细胞分化的标志物（前文提到过过表达NAT10可以使RUNX2表达水平升高）。IGV峰图显示ac4C peak存在于RUNX2 mRNA的3′UTR区域中，并在沉默NAT10后消失（下图F），表明NAT10可能添加ac4C修饰到这些基因来调控成骨分化能力。

7. RUNX2是NAT10的靶基因并作为成骨分化-NAT10/ac4C轴的中介

发现RUNX2存在ac4C修饰后，作者进一步进行acRIP-qPCR和NAT10的RIP-qPCR验证这个发现。acRIP-qPCR结果显示RUNX2的ac4C修饰水平在沉默NAT10后最显著下调（下图A）。通过RIP实验可以看到在成骨诱导后，NAT10可以与RUNX2结合（下图B）；RIP-qPCR结果显示沉默NAT10后，NAT10与RUNX2结合下降（下图C）。

结合以上实验，考虑到mRNA上ac4C修饰可以增加其稳定性（结合康测科技之前文献解读，5’UTR中ac4C修饰与翻译起始有关，而其余区域的ac4C修饰，比如3’UTR则会增加mRNA稳定性），作者合理推测NAT10可以通过对RUNX2添加ac4C修饰从而维持其mRNA的稳定性。与在PM中培养的BMSCs相比，在OM中培养的BMSCs中RUNX2 mRNA的半衰期增加，而在沉默NAT10后RUNX2的半衰期明显下降（下图D）。沉默NAT10后，RUNX2的基因表达和蛋白质水平均显著降低（下图E、I）；过表达NAT10可以增加RUNX2 mRNA的表达水平，而Remodelin处理可以逆转过表达NAT10带来的结果。

最后，ARS和ALP染色显示，在沉默NAT10后，BMSCs形成较少的钙结节，但过表达RUNX2可以逆转NAT10缺失带来的影响（下图F-H）。

另外，WB结果显示，过表达NAT10可以挽救OSX（成骨分化标志物）缺失带来的影响。

这些结果共同表明NAT10通过添加ac4C修饰维持RUNX2 mRNA稳定性直接调控其表达水平，从而调控体外BMSCs的成骨分化的能力。

与mRNA中m6A和m5C修饰研究套路相同，ac4C研究离不开Writer、Reader和Eraser。但是由于ac4C修饰研究还处于初期，Writer只鉴定出NAT10一种，而Reader和Eraser目前还没有报道，因此大部分研究只能瞄准NAT10做文章。当您研究的表型如果出现NAT10的表达异常，那最直接的研究手段就是通过acRIP-seq/ac4C-seq找到发生ac4C修饰水平变化的靶基因，并通过NAT10 RIP-seq/RIP-qPCR进行验证，那我们总结下作者的工作：

1. 首先通过qPCR和dot plot观察到骨质疏松表型的组织NAT10表达水平和整体ac4C修饰水平明显降低；

2. 过表达NAT10可以逆转OVX小鼠的骨质流失，用NAT10抑制剂Remodelin处理的OVX小鼠加重骨质流失，其中破骨细胞的数量没有变化，说明NAT10不影响破骨细胞分化过程，因此NAT10很有可能调节BMSC的成骨细胞分化；

3. 再次通过qPCR和dot plot验证BMSCs成骨细胞分化过程中NAT10表达水平和ac4C修饰水平显著升高；

4. 将NAT10过表达/沉默可以促进/抑制BMSCs成骨分化过程；

5. 进行acRIP-seq鉴定发生ac4C修饰的靶基因RUNX2，修饰分布在3’UTR区；

6. 随后acRIP-qPCR验证acRIP-seq结果，NAT10 RIP-qPCR验证NAT10可以结合RUNX2并添加ac4C修饰；

7. mRNA降解实验说明过表达/沉默NAT10可以使RUNX2 mRNA稳定性上升/下降，说明3’UTR区的ac4C修饰对RUNX2 mRNA稳定性维持相当重要；

8. 最后过表达RUNX2可以逆转缺失NAT10带来的影响，表明NAT10通过添加ac4C修饰维持RUNX2 mRNA稳定性直接调控其表达水平，从而调控体外BMSCs的成骨分化的能力。

文献中康测已有产品：acRIP-seq；ac4C-seq

Yang W, Li HY, Wu YF, Mi RJ, Liu WZ, Shen X, Lu YX, Jiang YH, Ma MJ, Shen HY. ac4C acetylation of RUNX2 catalyzed by NAT10 spurs osteogenesis of BMSCs and prevents ovariectomy-induced bone loss. Mol Ther Nucleic Acids. 2021 Jul 2;26:135-147.

DOI: 10.1016/j.omtn.2021.06.022.