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在家养哺乳动物中，低温胁迫会降低幼崽的存活率，增加管控成本。胎儿棕色脂肪组织(fetal brown adipose tissue, FBAT)是幼崽的主要产热组织，它以热量的形式散发化学能，有助于幼崽保持存活的核心温度。BAT的非颤抖热量由解偶联蛋白1（UCP1）的表达介导，补偿了新生儿肌肉产生的热量不足。

在人类和小鼠中，转录因子（TF）网络，如早期B细胞因子2（EBF2）、过氧化物酶体增殖激活受体γ（PPARG）和核因子I-A（NFIA）被鉴定为与FBAT分化相关的关键转录因子。最近的研究进展表明，维持关键基因结合位点的染色质可及性对于FBAT的产生热能至关重要，转录组学也揭示了部分RNA分子可以参与了山羊、牛和家兔的FBAT发育过程。然而，对FBAT发育过程中表观遗传调控机制的了解，特别是早期FBAT发育，在家养哺乳动物中仍然在很大程度上是未知的。

因此作者以家兔为研究对象，在康测科技利用ATAC-seq、RNA-seq和 miRNA-seq技术开展以下研究。

1. 家兔早期FBAT发育过程中的组织特征和基因表达变化

首先，分别从妊娠第21天（G21）和妊娠第24天（G24）的胎兔肩胛间区采集FBAT。从第21天到第24天，多项数据显示胎兔FBAT的产热能力和脂质含量都有明显增加：组织切片显示胎兔的FBAT急剧增多（如下图）；

H&E染色显示，细胞大小、脂质含量和成熟棕色脂肪细胞（多房脂肪细胞）的数量也都有明显增加，如下图；

RT-qPCR结果显示UCP1、CIDEA、PPARGCIA、COX1、COX2、ND1、ND2等多个基因的表达水平有了显著上升，其中UCP1基因基因表达水平显着上调了约700倍（p<0.01），如下图。

为了确认胎兔从第21天到第24天体内的基因表达变化，作者对FBAT进行RNA-seq。将第24天的FBAT样品对比第21天的样品，显示有1198个基因表达显著上调而1618个基因表达显著下调，如下图。

然后对表达差异基因分上下调分别进行GO和KEGG分析。结果发现在上调基因富集分析中，按P值排序前10个显著富集的GO-BP通路均与能量代谢有关。除能量代谢，上调基因也显著到富集到脂质代谢相关的通路上。KEGG分析也显示上调基因在线粒体代谢和产热相关通路上显著富集，如carbon metabolism、citrate cycle和thermogenesis等。

而在下调基因富集分析中，按P值排序前10个显著富集的GO-BP通路则均与细胞增殖有关。同样，下调基因的KEGG分析显示也富集到了细胞增殖过程相关的通路上，如下图。

为了研究FBAT发育过程中转录后表观遗传调控，作者又进行了miRNA-seq以确定从G21到G24胎兔的miRNA表达变化状况。结果显示一共检测到1097个miRNA表达，其中已知的miRNA有533个，新鉴定出的miRNA有564个。表达上调与下调的已知miRNA分别有57个和53个，在新miRNA中则分别为77个和76个。

2. 早期FBAT发育过程中染色质可及性的变化

作者检测FBAT转录水平情况后，将目光转向表观调控并进行ATAC-seq。所有基因的平均ATAC-seq信号分布表明转录起始位点（Transcription Start Sites，TSS）有特征性的峰（因为染色质可及性最高的地方主要分布在TSS区域），如下图。

在G21和G24两组样品中分别鉴定出了131739和130561个Peak。Peak在功能区的占比分别如下图。

差异Peak分析结果表明有7103个Peak表达上调，9843个Peak表达下调，如下图左。通过对差异Peak关联基因做GO富集分析，发现这些基因显著富集到与酶活性相关的GO-BP通路，如下图右。  

分别对上下调Peak做motif分析，结果显示排名前列显著富集的上调Peak转录因子结合motif分别是EBF2、CEBPB和NF1-halfsite等，下调Peak转录因子结合motif分别是CJUN、ATF2和CREB5等，如下图。

3. 早期FBAT发育过程中染色质可及性的近端调控和miRNA调控

前两部分作者获得FBAT发育的染色质可及性和转录图谱，接着开展进一步分析来发现发育调控机制。作者首先分析了不同区域上的Peak与相应邻近基因表达水平之间的关系，结果显示启动子中的Peak在调节基因表达水平方面表现出最高的关联性（R = 0.33，p值<0.01），如下图。

在上调脂肪生成基因（如LPL，FABP4，CEBPA和ADIPOQ）的启动子区域，以及上调的产热基因UCP1和CIDEA中发现了染色质可及性增加。这些结果说明了染色质可及性在启动子区对近端调控的重要性，如下图。

作者接着分析miRNA是否靶向含有启动子区域Peak的蛋白质编码基因（PCG）。结果表明从G21到G24，共有816个PCG的转录水平被启动子区的染色质可及性和miRNA调控。在上调的PCG中，上调miRNA的比例高于下调，表明对于上调PCG来说miRNA介导的负调控的效果低于染色质可及性介导的正调控。而在下调PCG中，上调miRNA的比例也高于下调的miRNA，表明对于下调PCG来说miRNA介导的负调控的效果则高于染色质可及性介导的正调控。

4. EBF1是FBAT早期发育过程的关键转录调控因子

DNA结合蛋白直接占据的DNA序列在ATAC-seq文库构建过程中会受到保护，不会发生转座，从而导致ATAC-seq信号的缺失，这就是转录因子足迹分析。为了进一步确定参与FBAT发育的关键转录因子，足迹分析显示在765个脊椎动物TF中，有41个TF的足迹显著增加，36个TF足迹显著减少，如下图。

从G21到G24，足迹增加最大的五个TF是EBF1、EBF3、EBF2、CTCF和NFIB，这表明足迹增加的TF可能是负责调控兔子早期FBAT的发育过程，如下图。

结合转录组的数据发现，从G21到G24一共有390个表达的TF，其中有27个上调32个下调。显著上调的TF含有许多与脂肪生成相关的TF，如EBF1、CEBPB和PPARG，而主要负责棕色脂肪生成TF—EBF2则中度上调（log2FC = 0.83，Padj = 0.077）。对TF的基因表达水平变化和足迹变化的综合分析发现，从G21到G24共有18个TF在全基因组开放染色质区域中的基因表达和足迹变化发生了显著变化，其中CEBPB、FOXN1和EBF1不仅基因表达水平显著上调，而且足迹也显著增加，EBF1具有最高的基因表达水平和最多结合上调表达基因的比例，同时此前的上调Peak也存在EBF1的motif，说明EBF1是调控兔早期FBAT发育过程的关键转录因子。

作者随后进一步进行EBF1级联结合预测分析确定调控机制以及miRNA调控与EBF1的关系，有兴趣大家可以查看原文，这里不再展开。

1. 作者首先利用ATAC-seq、RNA-seq和miRNA-seq构建兔FBAT发育过程中的染色质可及性和转录图谱，初步分析发育过程中相关基因的染色质可及性和转录水平变化；

2.  通过ATAC-seq中转录因子足迹分析，并结合RNA-seq数据确定EBF1是调控兔早期FBAT发育过程的关键转录因子；

3. 通过EBF1级联结合分析预测其级联调控网络，该网络在调节早期FBAT发育中起着重要作用。

Du K, Shi Y, Bai X, Chen L, Sun W, Chen S, Wang J, Jia X, Lai S. Integrated Analysis of Transcriptome, microRNAs, and Chromatin Accessibility Revealed Potential Early B-Cell Factor1-Regulated Transcriptional Networks during the Early Development of Fetal Brown Adipose Tissues in Rabbits. Cells. 2022 Aug 28;11(17):2675. doi: 10.3390/cells11172675. PMID: 36078081; PMCID: PMC9454897.