20220930文献解读 | 乙酰辅酶A代谢可以驱动表观基因组改变并增加脂肪肝病人的致癌风险

在全世界范围内，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)导致的肝细胞癌(HCC)发病率正在逐年增加，但癌前肝细胞中导致HCC驱动基因突变的步骤尚不清楚。饮食与表观遗传高度关联，因为表观遗传修饰的分子底物也是代谢过程的中间产物，其中最常见的例子即是组蛋白乙酰化：乙酰辅酶A（acetyl-CoA）可以从脂肪和碳水化合物中为组蛋白乙酰化提供乙酰基。前期研究报道大鼠脂肪肝模型中乙酰辅酶A绝对水平升高。在人类NAFLD肝脏中，乙酰辅酶A 转化为DNL，以及在三羧酸（TCA）循环中的氧化上调，而与健康肝脏相比生酮作用则减少。

考虑到代谢，表观遗传和癌症之间的机制联系，我们假设受干扰的乙酰辅酶A的代谢和组蛋白乙酰化可能是NAFLD患者导致HCC风险增加的因素，因此作者展开以下实验。

1. 肝脏脂肪变性时组蛋白乙酰化和染色质状态改变情况

为了验证脂肪性肝细胞中组蛋白乙酰化水平升高的假设，作者首先检查了肝脏和肝细胞脂肪变性的啮齿动物和细胞培养模型。研究结果表明处理组与对照组相比较，H4K16ac修饰水平增加（如图A、B)；利用油酸对人的IHH细胞培养，与对照组相比，油酸中培养的IHH细胞脂质含量明显增加（如图C）,利用荧光显微镜观察并采用一种评估全基因组核凝集的方法发现油酸处理可以明显使染色质解凝（如图D），这些结果证明了脂肪变性与广泛的组蛋白乙酰化和表观基因组改变有关。

2. 肝细胞脂肪变性与ɣH2AX增加有关，这种增加可通过抑制乙酰辅酶A的产生而逆转

通过对ɣH2AX（一种公认的DNA损伤标志物，脂肪变性的肝脏中水平会升高）进行免疫荧光染色来评估全局染色质变化是否与DNA损伤相关，结果显示与对照培养细胞相比，油酸处理使IHH细胞中ɣH2AX含量显著增加（如图B,蓝色核染色，粉色为ɣH2AX）；使用乙酰辅酶A抑制剂与油酸共同培养细胞发现ɣH2AX含量减少与非脂肪变性细胞相当。（如图A)

3. 脂肪变性的肝细胞中ɣH2AX水平最高的基因组区域聚集在一起，并含有肝癌中常见的突变基因

作者为了确定基因组中哪些区域经历了与脂肪变性相关的ɣH2AX增加，分别使用H4K16ac和ɣH2AX抗体进行ChIP-seq，结果显示脂肪变性肝细胞中ɣH2AX水平升高最高的基因组区域聚集在一起，其中包含了TERT、PLEGHG4B、IRX4等肝癌中常见的突变基因。TERT基因是HCC中最常见的突变基因，在脂肪细胞中具有高组蛋白乙酰化和ɣH2AX 水平，这表明该机制可能有助于致癌。

为了研究人类体内脂肪变性与ɣH2AX是否也会发生类似动物模型中的机制，作者利用ChIP-seq和WGS数据分析证实脂肪变性IHH细胞中 ɣH2AX水平高的区域富含NAFLD和酒精相关肝病（ARLD）相关的SNV位点，而对照IHH细胞中ɣH2AX水平高的区域则没有突变位点（如图A、B)。这些分析表明，被鉴定为对IHH细胞中代谢相关的表观遗传变化敏感的基因组区域也是患病人类肝脏中频繁突变的区域。

4. TERT基因在脂肪变性中具有高水平的组蛋白乙酰化和ɣH2AX，可以用乙酰化抑制剂逆转

TERT基因的突变是肝细胞癌中最早检测到的突变，利用ChIP-seq结果和ChIP-qPCR验证比较TERT启动子区域与已知的肝癌后期突变的其他肿瘤抑制基因，结果表明TERT启动子区域，H4K16ac和ɣH2AX增加了近40倍，远高于PTEN基因和TP53中修饰增加水平（如图A）。接着作者使用乙酰化抑制剂BMS或组蛋白乙酰转移酶抑制剂藤黄醇对细胞进行处理，ChIP-qPCR结果显示添加抑制剂可降低TERT启动子区H4K16ac修饰和ɣH2AX水平。同样仅在人脂肪肝的TERT基因座区域观察到高水平的ɣH2AX（如图B）。

5. 基因组规模的代谢网络模型构建和RNA-seq揭示油酸处理肝细胞导致脂肪肝可能机制

为了获得对油酸如何增加ɣH2AX水平以及如何通过抑制乙酰辅酶A产生的药物降低的机制，通过构建代谢网络模型发现油酸处理具有多种代谢效应，可以影响中心碳、脂肪酸、氨基酸和叶酸代谢途径。该模型预测，与脂肪变性相关的ɣH2AX增加及其逆转都与氧化还原代谢有关（如图A）。加入乙酰辅酶A抑制剂可以增加叶酸代谢和降低氧化磷酸化，最终导致ɣH2AX水平降低（如图B）。

为了进一步研究通过补充油酸改变的细胞过程以及可能构成组蛋白乙酰化和ɣH2AX变化的细胞过程，作者对来自3组的IHH细胞进行了RNA-seq，三组分别为对照培养基中生长细胞，补充油酸的培养基中生长的细胞；补充油酸并添加组蛋白乙酰转移酶抑制剂Garcinol中生长的细胞（如图C）。根据DEG和GSEA分析结果显示氧化应激等通路中富集许多相关基因。作者还发现被鉴定为具有最大H4K16ac和ɣH2AX peak增加的区域对蛋白质编码基因似乎没有任何整体的簇特异性转录效应，所有簇都混合了显着上调和下调的基因。但是油酸处理组的细胞具有更高百分比的非编码RNA。详细研究可以阅读原文，这里不再展开。

本研究从全新的代谢角度揭示饮食与表观遗传的关联以及如何影响脂肪肝和增加肝癌的患病风险。

1. 脂肪肝患者肝细胞乙酰化水平发生变化；

2. ɣH2AX免疫荧光染色显示ɣH2AX在脂肪肝患者的肝细胞中上升，而且用乙酰辅酶A抑制剂处理可以使ɣH2AX水平降低；

3. H4K16ac和ɣH2AX的ChIP-seq结果显示H4K16ac修饰和ɣH2AX水平升高的区域与导致肝癌的基因相关（TERT等）；结合SNV数据发现这些基因突变频率很高；

4. 使用乙酰辅酶A抑制剂可以使TERT基因启动子区域H4K16ac修饰和ɣH2AX水平降低；

5. 基因组规模的代谢网络模型构建和RNA-seq揭示油酸处理肝细胞导致脂肪肝可能机制。