20220902文献解读 | NSUN2调节的m5C修饰促进食管鳞状细胞癌扩散需依赖LIN28B介导GRB2的RNA稳定性

食管鳞状细胞癌(ESCC)是最恶性的癌症之一，由于缺乏有效的治疗方式，其5年生存率仅为19%。因此，迫切需要进一步阐明ESCC的综合分子机制，以开发更有效的ESCC诊断和治疗干预措施。

5-甲基胞嘧啶(m5C)是一种参与许多关键生物过程的转录后RNA修饰。NSUN2和NSUN6是哺乳动物中主要负责mRNA m5C甲基化修饰的Writer，近期文献报道NSUN2异常表达或者突变会导致众多疾病和癌症的产生，但是其调控机制还尚不清楚。

在本研究，作者是如何通过一步步的研究来揭示m5C表观遗传修饰在ESCC中的调控机制呢，让小编带大家拨云见日吧~

1. NSUN2异常上调在ESCC中发挥致癌作用

首先，作者确定了mRNA的m5C 修饰在ESCC中的作用。通过qRT-PCR评估了ESCC患者样本中两种主要mRNA m5C甲基转移酶NSUN2和NSUN6的表达水平，发现肿瘤中NSUN2的mRNA水平异常，高于邻近的正常组织（下图A）。但没有观察到NSUN6 mRNA 的表达差异（下图B）。此外， III/IV期ESCC患者的NSUN2水平高于I/II期患者（下图C）。Kaplan-Meier分析显示，NSUN2 RNA水平高的患者总生存时间（OS）比低水平的患者短（下图D）。

作者进一步通过蛋白质印迹（下图E）和免疫组织化学染色（IHC）（下图F，G）评估了ESCC中NSUN2的蛋白质水平。结果一致认为，NSUN2的蛋白水平也与肿瘤分期显著相关（下图H），并且与较差的预后相关（下图I）。 

以上结果表明， NSUN2在ESCC中经常处于上调表达状态，可作为 ESCC患者的预后指标。

随后作者通过分析公共数据库中的数据，发现E2F1是主要调控NSUN2异常表达的转录因子，如下图，由于与下文关联性不大，此处不再展开。

2. NSUN2增强ESCC的肿瘤发生和进展

随后，作者通过改变NSUN2在ESCC细胞中的表达来研究其作用。实验表明，过表达NSUN2显著促进细胞增殖、迁移和侵袭，而沉默NSUN2显示相反的效果（下图A-D）。然而，过表达NSUN2催化突变体（MUT1或MUT2）对ESCC细胞的恶性表型没有明显影响（下图E，G）。此外，过表达野生型但非突变型NSUN2显著逆转了敲低NSUN2对ESCC细胞恶性表型的抑制作用（下图F，H）。这些体外结果表明NSUN2在ESCC细胞中的致癌作用。

接下来，作者用化学致癌物4-硝基喹啉N-氧化物(4-NQO)处理Nsun2敲除小鼠（Nsun2+/-）及其野生型 (Nsun2+/+)来确定Nsun2是否具有癌基因的作用（下图 I）。在停药4或8周后观察到Nsun2+/+小鼠的食管非典型增生病变或鳞状细胞癌。IHC分析显示正常食管上皮、非典型增生病变和ESCC肿瘤组织中NSUN2蛋白连续上调（下图 J）。所有Nsun2+/+小鼠在4-NQO停药12周后出现食管肿块，但在此时间点并非所有(8/10)Nsun2+/-小鼠出现此症状（下图K）。Nsun2+/-小鼠的肿瘤数量和肿瘤大小均小于Nsun2+/+小鼠（下图 L，M）。组织病理学分析显示，Nsun2+/+小鼠的食管肿瘤阶段分期比 Nsun2+/-小鼠的高（下图N）。同样地，Nsun2+/+小鼠的预后比Nsun2+/-小鼠差（下图O）。这些发现表明NSUN2在ESCC的致瘤性和进展中起关键作用。

3. NSUN介导的m5C高甲基化激活ESCC中的PI3K/AKT和ERK/MAPK信号

NSUN2的致癌作用被证明后，作者又关心NSUN2的原癌基因作用在ESCC中是否依赖于m5C，作者对ESCC样本的polyA+ RNA进行RNA亚硫酸氢盐测序（bsRNA-seq），以单碱基分辨率阐明ESCC的转录组中m5C修饰模式。

bsRNA-seq结果表明，1362个转录本中有4051个位点与正常组织相比被高甲基化，626个转录本中的1627个位点在肿瘤中被低甲基化（下图A，B）。通路富集分析表明，肿瘤中的m5C高甲基化转录物主要富集在癌症相关通路中，例如PI3K/AKT、ERK/MAPK和细胞表面激活受体相关通路（下图C）。后续实验也表明，许多参与这些途径的癌基因在肿瘤中表现出m5C高甲基化（下图D，E）。

随后，作者用 m5C meRIP-qPCR 随机验证了几个涉及这些途径基因的mRNA m5C修饰情况，发现它们在肿瘤中的m5C修饰水平均上调（下图F），这与bsRNA-seq结果一致（下图G）。此外，这些基因的mRNA的m5C 水平与ESCC中NSUN2的RNA水平呈正相关（下图H）。相应地，沉默NSUN2会降低ESCC细胞中这些转录物的m5C水平，而过表达NSUN2会产生相反的效果（下图I）。

以往的研究报道，PI3K/AKT和ERK/MAPK通路是多个细胞表面激活受体相关（VEGF、整合素等）通路的两条主要下游通路，并且在本研究结果中这些通路中的许多mRNA被高甲基化（下图E）。因此，作者假设NSUN2介导的m5C修饰增多可能主要通过调节PI3K/AKT和ERK/MAPK信号传导来促进ESCC肿瘤进展。后续验证也表明，NSUN2敲低能抑制PI3K/AKT和ERK/MAPK通路的激活（下图J）。这种抑制只能通过野生型而不是催化域突变型NSUN2的过表达来逆转（下图K）。以上结果表明NSUN2介导的m5C高甲基化可能触发PI3K/AKT和ERK/MAPK通路从而促进肿瘤恶化。

4. GRB2是NSUN2刺激PI3K/AKT和ERK/MAPK信号传导的关键靶点

为了确定NSUN2介导的PI3K/AKT和ERK/MAPK信号激活的下游效应子，作者评估了ESCC肿瘤中m5C修饰丰度较高的潜在靶标。鉴于以上研究得出GRB2在PI3K/AKT和ERK/MAPK信号转导中起核心作用，且NSUN2通过其m5C催化活性正向调节GRB2 mRNA的m5C修饰水平，表明GRB2是NSUN2的底物。因此，作者专注于衔接蛋白GRB2。而进一步的实验也表明，GRB2沉默显著抑制了ESCC细胞中的PI3K/AKT和ERK/MAPK信号传导（下图A）。过表达GRB2能部分恢复NSUN2耗尽细胞中PI3K/AKT和ERK/MAPK途径的激活（下图B），表明GRB2 是 NSUN2 激活这两种途径的关键靶标。

随后作者探究了NSUN2介导的m5C形成对GRB2的影响。结果表明，敲低NSUN2显著降低了ESCC细胞中GRB2的RNA和蛋白质水平，而NSUN2过表达则呈现相反的结果（下图C，D）。此外，过表达野生型而非突变型NSUN2恢复了NSUN2敲低细胞中的GRB2的转录（下图E）和蛋白（下图F）水平。

与上面结果一致，在4-NQO诱导的ESCC小鼠模型中，正常食管上皮、非典型增生病变和ESCC肿瘤中GRB2水平和PI3K/AKT、 ERK/MAPK 通路的激活水平逐渐升高（下图G）。在Nsun2+/+小鼠的食管组织中也观察到GRB2表达水平和两种途径的激活水平高于Nsun2+/-小鼠（下图H）。此外，在ESCC中发现GRB2的RNA水平与NSUN2的RNA水平（下图I）或GRB2的m5C水平（下图J）之间存在正相关性。

5. LIN28B识别GRB2的m5C修饰并稳定GRB2的mRNA

m5C修饰如何决定mRNA命运是通过不同m5C Reader蛋白识别所决定，但是作者沉默已知的Reader蛋白YBX1对GRB2的mRNA水平没有影响。为了鉴定m5C的mediator，作者对生物素标记的50-bp GRB2或m5C-GRB2的RNA探针进行pull-down，获得的蛋白质进行MS，结果显示鉴定了七种优先与m5C-GRB2探针结合的蛋白（下图A），其中，只有LIN28B通过WB（下图B）和REMSA测定（下图C）得到验证。LIN28B具有一个保守的冷休克结构域 (CSD)，此结构域与m5C Reader YBX1的结构域类似，作者推测LIN28B可以通过CSD结合m5C修饰位点。随后用REMSA实验证实LIN28B可以通过CSD结构域结合GRB2 mRNA上的m5C位点（下图D)。

此外，作者发现LIN28B的mRNA水平在ESCC肿瘤中上调，并且与GRB2的RNA水平呈正相关（下图J，K）。LIN28B沉默显著降低了GRB2的mRNA（下图L）和蛋白质（下图M）水平，并且还降低了GRB2 mRNA的稳定性（下图N）。在LIN28B敲低细胞中GRB2-WT的荧光素酶表达强烈降低，而GRB2-MUT没有这种影响（下图O）。这些发现表明LIN28B是一种新型m5C调节器，可识别m5C修饰的GRB2并稳定其mRNA。

作者通过分析公共数据库的数据，发现LIN28B可以识别其他mRNA分子的m5C位点，感兴趣的话可以看原文。最后作者通过临床实验证明GRB2的作用以及NSUN2-GRB2轴与预后的情况，这里不再展开

m5C与m6A修饰研究思路基本相同，而相比m6A，一些Reader蛋白或Eraser蛋白鉴定出的种类较少，因此还具备相当的潜在研究价值：

1. 作者发现NSUN2相比癌旁组织，在ESCC中异常表达；

2. bsRNA-seq结果显示由于NSUN2的异常高表达，ESCC肿瘤中RNA的m5C修饰水平异常升高。

3. 异常m5C修饰可以使PI3K/AKT和ERK/MAPK信号异常激活，导致癌症表型；

4. NSUN2可以正向调节GRB2在ESCC中发挥关键作用，而作者发现新m5C Reader蛋白LIN2B，其可以识别结合GRB2 mRNA上的m5C位点稳定GRB2 mRNA水平，而且LIN2B可以识别结合其它基因mRNA的m5C位点。

Su J ,  Wu G ,  Ye Y , et al. NSUN2-mediated RNA 5-methylcytosine promotes esophageal squamous cell carcinoma progression via LIN28B-dependent GRB2 mRNA stabilization.[J]. Nature Publishing Group, 2021(39).