IF 14.3|郑大一附院揭示lncRNA evf-2调控糖尿病肾病中足细胞损伤机制
快速导读
蛋白尿是糖尿病肾病（DN）的标志。足细胞损伤是导致DN蛋白尿的重要原因。目前，开发针对足细胞功能的创新治疗策略仍十分迫切，尤其是解决DN中细胞周期失调和炎症问题。
LncRNA可以与DNA、RNA和蛋白质相互作用，通过不同机制（包括表观遗传、转录和转录后调控）调节相关基因表达，从而影响DN的发病和进展。LncRNA evf-2（人Gene ID: 285987, 小鼠Gene ID: 320 038）在DN患者尿液和肾组织中表达上调，但evf-2在DN中的作用未知。
2024年10月，郑州大学第一附属医院郭佳与刘章锁老师团队在Advanced Science（IF 14.3）上发表了题为“LncRNA evf-2 Exacerbates Podocyte Injury in Diabetic Nephropathy by Inducing Cell Cycle Re-entry and Inflammation Through Distinct Mechanisms Triggered by hnRNPU”的研究文章，揭示了lncRNA evf-2调控DN中足细胞损伤的作用机制。研究发现DN中lncRNA evf-2表达上调，并与足细胞损伤、炎症以及细胞周期再进入相关。机制显示DN中lncRNA evf-2结合hnRNPU，并可能触发不同机制（转录激活、可变剪接、RNA稳定性以及翻译调节），进而调节细胞周期相关基因和炎症因子的表达，最终诱导DN中足细胞损伤、炎症和细胞周期再进入。
康测科技为本研究提供ChIP-seq技术服务，鉴定hnRNPU结合的下游靶基因和结合位点。
研究思路
研究结果
一、LncRNA Evf-2表达上调与糖尿病肾病中足细胞损伤呈正相关
作者发现DN肾组织中evf-2、炎症因子（如Mcp-1、B7-1）以及PCNA表达增强，而足细胞标志蛋白（如podocin、SYNPO）表达降低（Figure 1a）。在DN患者活检中观察到双核足细胞（Figure 1b）。采用链脲佐菌素（STZ）注射联合高脂饮食（HFD）诱导DN小鼠模型，作者发现DN小鼠模型肾小球中evf-2的表达水平与尿蛋白/肌酐比值（uACR）呈正相关（Figure 1c-e）。DN小鼠肾小球中evf-2、炎症因子以及PCNA表达增加而足细胞标志蛋白表达降低（Figure 1f,g）。与对照小鼠相比，DN小鼠中Mcp-1、B7-1或损伤因子Claudin-1与podocin或SYNPO有更多的共定位（Figure 1g）。WB证实DN小鼠中Mcp-1、B7-1和Claudin-1表达更高而podocin表达更低（Figure 1h）。这些结果提示DN小鼠模型中细胞周期再进入和足细胞炎症可能导致蛋白尿，并与evf-2表达增加密切相关。
二、足细胞特异性敲低Evf-2减轻STZ联合HFD处理小鼠中足细胞损伤、炎症和蛋白尿
HFD处理4周后，小鼠分别接受生理盐水（STZ + saline）、空白慢病毒（STZ + con-shRNA）和足细胞特异性evf-2 shRNA慢病毒（STZ + evf-2 shRNA）处理，qRT-PCR证明足细胞特异性敲低（KD）evf-2成功（Figure 2a）。作者发现足细胞特异性敲低evf-2的小鼠12周后uACR水平更低（Figure 2b）。肾组织中uACR与evf-2表达水平呈正相关（Figure 2c）。然而，随机血糖（RBG）或肾重/体重（KW/BW）比值没有显著变化（Figure 2d,e）。此外，足突数量增加和肾小球基底膜（GBM）厚度减少提示evf-2 KD小鼠中足细胞损伤减少（Figure 2f）。evf-2 KD小鼠中evf-2表达减少而podocin表达增加（Figure 2g）、炎症或损伤相关因子与足细胞标记蛋白的共定位减少、PCNA阳性染色减少（Figure 2h）。WB证明evf-2 KD小鼠中 Mcp-1、B7-1和Claudin-1表达降低而podocin表达增加（Figure 2i），上述结果说明，抑制肾足细胞中evf-2的表达可以减轻DN相关的足细胞损伤、炎症和蛋白尿。
三、足细胞特异性过表达Evf-2促进对照小鼠中足细胞损伤、炎症和细胞周期再进入
对C57小鼠（对照小鼠）分别进行生理盐水（CON+saline）、空白慢病毒（CON+con-LV）和足细胞特异性evf-2过表达慢病毒（CON+evf-2）处理，qRT-PCR证明足细胞特异性过表达evf-2成功（Figure 3a）。作者发现CON+evf-2组12周后uACR水平更高（Figure 3b），uACR与evf-2水平呈正相关（Figure 3c）。RBG或KW/BW无明显变化 (Figure 3d,e)。此外，CON+evf-2组中肾组织基质增加、基底膜增厚、足细胞足突融合（Figure 3f），evf-2表达增加而podocin表达减少（Figure 3g），足细胞标志蛋白的表达逐渐降低而炎症和损伤相关因子的表达增加（Figure 3g-i），PCNA阳性染色增多（Figure 3h）。上述结果证明，过表达evf-2可以促进C57小鼠中足细胞损伤、细胞周期再进入、炎症和蛋白尿。
四、足细胞特异性敲除Evf-2减轻STZ诱导的糖尿病小鼠中足细胞损伤和炎症
作者构建了足细胞特异性敲除evf-2（evf-2 KO）小鼠，并对6周龄雄性evf-2 KO和flox/flox小鼠（作为对照）采用STZ联合HFD诱导构建DN模型。作者发现STZ处理7周后，flox/flox小鼠比evf-2 KO小鼠体型更小、更瘦、状态更差（Figure 4a）。evf-2 KO小鼠中uACR和KW/BW明显低于flox/flox小鼠（Figure 4c,d），但RBG无显著差异（Figure 4b）。qRT-PCR和FISH证明足细胞特异性敲除evf-2成功（Figure 4e,f）。此外，evf-2 KO小鼠中基质积累和足细胞足突融合明显减轻（Figure 4g）、PCNA阳性染色减少且足细胞损伤较轻（Figure 4h,i）以及Mcp-1、B7-1和Claudin-1表达降低而podocin表达增加（Figure 4k）。这些结果表明，足细胞特异性敲除evf-2可以减轻糖尿病小鼠模型中的足细胞损伤、炎症和蛋白尿。
五、足细胞特异性敲除Evf-2显著减轻LPS诱导的小鼠模型中足细胞损伤和炎症
LPS诱导后，flox/flox小鼠和evf-2 KO小鼠的外观存在明显差异（Figure 5a）。与LPS处理的evf-2 KO小鼠相比，flox/flox小鼠表现出更明显的体重减轻、毛发粗糙和呼吸急促（Figure 5c）。qRT-PCR证实了足细胞中evf-2的敲除（Figure 5b）。LPS处理的evf-2 KO小鼠中uACR、uIgG/cr、uRBP/cr和uNAG/cr均低于flox/flox小鼠（Figure 5d,e）。这反映出LPS诱导的evf-2 KO小鼠中肾小球和肾小管损伤更轻。
与LPS处理的evf-2 KO小鼠相比，flox/flox小鼠的形态学特征受到更严重的破坏，肾脏表面出现明显的颗粒状外观以及足细胞足突融合（Figure 5f），肾小球中podocin表达降低而炎症和损伤相关因子的表达增加（Figure 5g,h），足细胞足突减少且细胞间的突触连接被破坏（Figure 5h），Mcp-1、B7-1和Claudin-1表达增加而podocin表达降低（Figure 5i）。综上所述，足细胞特异性敲除evf-2减轻了LPS诱导的急性炎症损伤。
六、上调的Evf-2通过细胞周期再进入和炎症诱导足细胞损伤
之前的结果提示DN中足细胞存在细胞周期紊乱和炎症。足细胞作为终末分化细胞，通常位于G0期。但evf-2过表达后，G2/M期足细胞的百分比增加（Figure 6a）、足细胞标志蛋白podocin减少、足细胞的细胞骨架破坏以及双核足细胞比例增加（Figure 6b,c）。
对过表达evf-2和对照足细胞进行RNA-seq，作者发现差异基因在细胞周期相关通路富集（Figure 6d,e）。GSEA显示有丝分裂细胞周期、细胞分裂、IL-17和TNF信号传导有富集（Figure 6f,g）。RNA-seq和qRT-PCR表明过表达evf-2后，细胞周期和炎症相关的基因（如Prc1、Ccnd1、Ccnb1、Cd80、Lcn2等）表达上调（Figure 6h,i）。这意味着上调的evf-2诱导细胞周期再进入和足细胞炎症。
七、Evf-2结合参与mRNA加工或可变剪接的蛋白以诱导足细胞周期再进入或炎症
Evf-2定位在细胞核和核周区域（Figure 4f）。ChIRP-MS分析显示evf-2的结合蛋白大多在mRNA加工、RNA剪接、蛋白质折叠和核糖核蛋白复合物富集（Figure 7a,b）。RNA-seq表明过表达evf-2导致细胞内显著的可变剪接事件发生（Figure 7c）。GO和KEGG分析显示，差异可变剪接基因在细胞代谢、RNA代谢和细胞周期相关过程富集（Figure 7d,e）。将参与有丝分裂细胞周期且表达上调的基因与差异可变剪接基因取交集，作者鉴定到Ccnb1和Tacc3（Figure 7f）。qRT-PCR表明Ccnb1-201/202和Tacc3-206/207在过表达evf-2后表达上调（Figure 7g）。总之，evf-2可能通过与核糖核蛋白复合物相关蛋白相互作用来调节转录、可变剪接和RNA稳定性，从而影响细胞周期和炎症相关基因的表达。
八、敲低hnRNPU可减轻Evf-2过表达诱导的细胞周期再进入和炎症因子表达增加
ChIRP-MS鉴定到的核糖核蛋白中，hnRNPU是与evf-2结合的最突出的剪接体相关蛋白。AlphaFold预测揭示了hnRNPU蛋白结构，提示hnRNPU可以与DNA和RNA结合（Figure 8a）。在过表达evf-2的足细胞中敲低hnRNPU导致进入G2/M期的细胞数量减少、双核足细胞比例降低以及细胞骨架紊乱得到改善（Figure 8b,c）。此外，敲低hnRNPU部分逆转由过表达evf-2导致的细胞周期和炎症相关基因的表达上调（除了Nek2和Ccnf）（Figure 8d）。敲低hnRNPU后，Ccnb1-201 和Ccnb1-202的表达显著降低，而Tacc3-206和Tacc3-207的表达没有降低，但Ccnb1-202/201和Tacc3-207/206比例均发生改变（Figure 8e,f）。综上所述，hnRNPU介导由evf-2过表达诱导的细胞周期再进入和炎症因子的表达上调。
九、hnRNPU直接结合细胞周期相关蛋白和趋化因子的 DNA或RNA，并调节其表达
作者使用hnRNPU抗体对过表达evf-2的足细胞分别进行ChIP-seq或RIP-seq，分别鉴定hnRNPU结合的DNA或RNA。结果表明，hnRNPU结合evf-2，结合Lcn2和Ccl20的DNA以及同时结合部分细胞周期蛋白和炎症因子的DNA/RNA（Figure 9a）。GO和KEGG分析表明ChIP-seq和RIP-seq中鉴定到的重叠基因在细胞周期和炎症相关通路中富集（Figure 9b,c）。作者进一步表征了hnRNPU在细胞周期或炎症相关基因上的结合情况（Figure 9d）。Gene plot展示了RIP-seq中hnRNPU在evf-2、Prc1、C3和Ccnb1上的结合（Figure 9e），motif结果与mCrossBase预测结果类似（Figure 9f,g）。此外，Gene plot还展示了ChIP-seq中hnRNPU在Prc1、C3和Ccnb1上的结合，同时作者还分析了排名靠前的目标DNA的结合motif（Figure 9h-j）。这些结果证明hnRNPU 与调节细胞周期和炎症的关键基因直接关联，并进一步阐明hnRNPU 在这些细胞过程中的复杂作用。
参考文献
Chaojie Zhang, Hui Zhao, Yufan Yan, et al. LncRNA evf-2 Exacerbates Podocyte Injury in Diabetic Nephropathy by Inducing Cell Cycle Re-entry and Inflammation Through Distinct Mechanisms Triggered by hnRNPU[J]. Advanced Science, 2024
热点推荐
点个“在看”再走呗（右下角）
更多平台
bilibili
（长干货科普）
视频号
（产品知识分享）
小红书
（短干货科普）
关于康测
康测致力于先进组学技术的开发和在生物医学研究领域的应用，建立了涵盖基因组学、表观基因组学、转录组学、表观转录组学、免疫组学和互作组学的全面组学服务体系。而在医学检测方面，康测基于自主研发的SMP（Stranded Multiplex PCR）靶向测序技术，可提供检测灵敏度和特异性均为100%的MRD一站式自动化解决方案。
康测提供全面的基因表达调控研究工具
康测提供高度自动化MRD一站式解决方案
